擬南芥兩個(gè)在花中特異表達(dá)的Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白的分子生物學(xué)研究.pdf

1、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITP)普遍存在于多細(xì)胞動(dòng)物、真菌及高等植物中。PITP能結(jié)合及交換一分子的磷脂酰肌醇或磷脂酰膽堿并能促進(jìn)這兩類脂分子在細(xì)胞內(nèi)膜組分間轉(zhuǎn)移。磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌囊泡的形成、運(yùn)輸、PLC(磷脂酶C)調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及神經(jīng)退化中具有重要的作用；PITP調(diào)節(jié)酵母胞質(zhì)內(nèi)膜組分運(yùn)輸和脂類的代謝；在高等植物的發(fā)育過(guò)程中參與了信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)氨基酸序列的保守性，PITP可以分成兩大類：一類是以哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和

2、昆蟲(chóng)為代表的多細(xì)胞動(dòng)物PITP；另一類是以真菌和高等植物為主的PITP。Sec14p是酵母中主要的PITP，對(duì)于酵母的存活和高爾基蛋白質(zhì)的分泌都具有重要的作用。目前研究較多的是哺乳動(dòng)物和酵母的PITP，而植物PITP的生理生化功能研究較少，特別是在有性生殖中的生物學(xué)功能尚未見(jiàn)報(bào)道。 根據(jù)擬南芥中的全基因組信息，通過(guò)生物信息學(xué)分析表明擬南芥可能存在著31個(gè)編碼Sec14p結(jié)構(gòu)域的植物PITP。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中全的長(zhǎng)cDNA的信息

3、，我們分離并鑒定了擬南芥中的兩個(gè)主要在花器官中表達(dá)的Sec14-like的PITP基因，分別命名為AtSFH3和AtSFH12。它們分別編碼548和543個(gè)氨基酸的蛋白。在其C末端連接著Sec14p-like的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)，在N末端是一個(gè)Nlj16-like結(jié)構(gòu)域。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析表明，它們的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Sec14p具有40％以上的相似性。 在酵母的功能互補(bǔ)試驗(yàn)中，我們將AtSFH3和AtSFH12的全長(zhǎng)cD

4、NA導(dǎo)入了兩個(gè)酵母Sec14ts單缺失突變體NY430和PGY84中。試驗(yàn)結(jié)果表明，在限制性溫度37℃下，兩個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA都能較好的互補(bǔ)Sec14p缺失引起的生長(zhǎng)缺陷。 利用半定量RT-PCR檢測(cè)AtSFH3和AtSFH12在組織器官特異性表達(dá)的結(jié)果表明，AtSFH3和AtSFH12主要在花器官中表達(dá)。其中，AtSFH3在擬南芥的花、莖和莢果中表達(dá)，且表達(dá)量依次降低，而在根和葉沒(méi)檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄活性；AtSFH12在花中的轉(zhuǎn)

5、錄活性最高，在其他器官的轉(zhuǎn)錄活性極低或者是不表達(dá)。這些研究結(jié)果和公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因芯片結(jié)果是一致的。 為了進(jìn)一步比較AtSFH3和AtSFH12在花器官的定位，我們構(gòu)建了Promoter-GUS轉(zhuǎn)基因株系研究AtSFH3和AtSFH12在花器官的精確定位，結(jié)果表明:AtSFH3和AtSFH12在花發(fā)育的不同時(shí)期及花的亞器官的分布具有較大的區(qū)別?；òl(fā)育的第11期，在花柱的表皮細(xì)胞表達(dá)能觀察到AtSFH3的表達(dá)，到了第12期AtS

6、FH3在成熟的孢粉囊中也有表達(dá)，在花發(fā)育的第13時(shí)期，花柱的表皮細(xì)胞，花柱中都能檢測(cè)到AtSFH3的表達(dá)，在成熟的花粉粒和落在柱頭上萌發(fā)的花粉也能觀察到AtSFH3的表達(dá)，表明AtSFH3在雌蕊和雄蕊都有表達(dá)。而AtSFH12只在花發(fā)育的第12時(shí)期的成熟花粉囊中開(kāi)始表達(dá)，到了第13期，花粉粒在柱頭上萌發(fā)時(shí)，萌發(fā)的花粉管中也能檢測(cè)到GUS活性，說(shuō)明在花的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，AtSFH12僅在成熟及萌發(fā)的花粉粒中有表達(dá)，在花器官的其他組織如雌蕊