同軸電紡P(3HB-CO-4HB)-(明膠+聚乙烯醇)復(fù)合hBMSCs構(gòu)建組織工程骨.pdf

1、目的：
　　采用同軸電紡技術(shù)以3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),P(3HB-CO-4HB))為芯，明膠(gelatin,GA)聚、乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)為殼制備骨組織工程支架,將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)負(fù)載于支架上，體外構(gòu)

2、建細(xì)胞-支架復(fù)合物，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討細(xì)胞-支架復(fù)合物在裸鼠體內(nèi)異位成骨能力。
　　方法:
　　取人髂前上棘骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，傳代培養(yǎng)至第5代，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原。更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，通過(guò)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase staining,AKP)染色、茜素紅(alizarinred staining,ARS)染色、I型膠原免疫組化染色檢測(cè)成骨分化情況。制

3、備8％ w/v的GA+PVA混合水溶液，作為同軸電紡的殼層溶液，以6% w/vP(3HB-CO-4HB)溶液作為芯層溶液，制備同軸電紡支架。采用掃描電鏡和透射電鏡觀察支架材料。同時(shí)以6%w/vGA作為殼層溶液，以6%w/vP(3HB-CO-4HB)溶液作為芯層溶液，制備同軸電紡支架后采用掃描電鏡觀察。制備以6% w/vP(3HB-CO-4HB)為芯，以8%w/v的GA+PVA為殼的同軸電紡支架，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞滴加在支架表面。將細(xì)胞

4、-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)第1天和第7天通過(guò)DAPI熒光染色觀察，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天和第14天通過(guò)掃描電鏡和DAPI染色觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況。復(fù)合物分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)、對(duì)照組采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩組分別培養(yǎng)14天后植入裸鼠皮下，分別于術(shù)后第8周和16周取出植入物行HE染色，Vonkossa染色，茜素紅染色，I型膠原免疫組化染色評(píng)價(jià)細(xì)胞-支架復(fù)合物在體內(nèi)異位成骨的能力。
　　結(jié)果：
　　hBMSC

5、s原代培養(yǎng)隨時(shí)間增加，貼壁細(xì)胞從圓形變?yōu)槎趟笮?，培養(yǎng)12天后，細(xì)胞融合至90%以上，傳代培養(yǎng)至第5代，hBMSCs變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，排列方向一致，成旋渦狀、平行狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105細(xì)胞表面抗原，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR表面抗原。將完全培養(yǎng)基更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮汀⒍嘟切巍Ｍㄟ^(guò)堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、I型膠原免疫組化染色顯示均為陽(yáng)性，未更換成骨誘導(dǎo)液誘

6、導(dǎo)培養(yǎng)的hBMSCs形態(tài)仍為長(zhǎng)梭形，相關(guān)骨化學(xué)染色為陰性。透射電鏡顯示芯為P(3HB-CO-4HB)，殼為GA+PVA制備的同軸電紡支架具有明顯芯-殼結(jié)構(gòu)，掃描電鏡顯示芯為P(3HB-CO-4HB)，殼為GA制備的支架見(jiàn)電紡成絲性較差，見(jiàn)大量的液滴，液滴表面有纖維伸出，但未能形成連續(xù)完整的纖維形態(tài)，其中部分纖維出現(xiàn)斷裂；而P(3HB-CO-4HB)為芯，GA+PVA為殼制備的支架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且相互連通，纖維直徑較為均一。熒光染色見(jiàn)細(xì)胞

7、-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)1天時(shí)見(jiàn)細(xì)胞較為均勻的分布于支架上，培養(yǎng)第7天時(shí)見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量增多，分布在支架上。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天和第14天時(shí)見(jiàn)大量細(xì)胞覆蓋于支架材料上。掃描電鏡見(jiàn)復(fù)合物成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞分布于支架材料表面，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天時(shí)見(jiàn)細(xì)胞覆蓋于支架材料表面，細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)良好，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋于材料表面。將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)，裸鼠生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)全身或局部炎癥及毒性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞-支架復(fù)合物在第8周、16周時(shí)保持原

8、狀，質(zhì)地逐步變硬；對(duì)照組細(xì)胞-支架復(fù)合物植入后8周時(shí)體積未見(jiàn)明顯縮小，質(zhì)地較軟；16周時(shí)幾乎完全降解。實(shí)驗(yàn)組HE染色、Vonkossa染色、茜素紅染色、I型膠原免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)骨組織形成，可見(jiàn)骨細(xì)胞及骨陷窩形成，鈣鹽沉積、I型膠原隨時(shí)間的增加逐漸增多并逐漸成熟。對(duì)照組相關(guān)骨化學(xué)染色陰性，未見(jiàn)骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨陷窩的形成。
　　結(jié)論：
　　人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合同軸電紡3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯/(明膠+聚乙烯醇)支