鈦納米管對鼠前成骨細胞生物學行為影響及作用機制.pdf

1、鈦由于具備優(yōu)良的機械和生物學性能已廣泛應(yīng)用于制作骨科與牙種植體，但由于其表面骨整合形成率較低，易引起種植體周圍炎，其遠期愈后及穩(wěn)定性較差。如何能夠改善鈦種植體的組織相容性，使其具備一定的促成骨功能以加速骨整合目前已經(jīng)成為骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點。對種植體材料表面拓撲結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化設(shè)計可為機體細胞產(chǎn)生積極應(yīng)答提供有利環(huán)境。二氧化鈦納米管陣列由于形態(tài)有序、管徑可控、具備較高表面親水性以及利于蛋白吸附等特征受到越來越多學者的關(guān)注。但針對不同管徑

2、大小對細胞成骨向分化等多種生物學行為的影響目前尚無定論。此外，細胞感受來源于材料表面結(jié)構(gòu)的機械刺激并產(chǎn)生生物應(yīng)答這一過程取決于細胞的粘附狀態(tài)，后者涉及到黏著斑激酶及細胞骨架調(diào)控蛋白相關(guān)機械信號傳導機制的激活，但關(guān)于該機制如何對細胞形態(tài)、增殖及分化進行調(diào)控，其下游信號轉(zhuǎn)導途徑及亞細胞水平變化等問題的研究尚不清晰。
　　目的：1.觀察不同管徑二氧化鈦納米管表面細胞的生物學行為變化；2.探討鈦納米管對細胞增殖能力的影響及其內(nèi)在機制；3.

3、探尋黏著斑激酶家族在納米管拓撲結(jié)構(gòu)促細胞成骨過程中的作用；4.考察FAK、RhoA和 YAP之間的相互關(guān)系及三者在細胞粘附及分化過程中所發(fā)揮的作用。方法：以陽極氧化法制備在鈦片及鈦種植體表面制備二氧化鈦納米管。1.掃描電鏡與原子力顯微鏡觀察其表面形貌及粗糙程度；分別在光滑面純鈦和不同管徑納米管材料表面培養(yǎng) MC3T3-E1細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察黏著斑及細胞骨架形成情況；以5-溴脫氧尿嘧啶核苷法（BrdU）測定細胞增殖能力，Real-

4、time PCR檢測其成骨相關(guān)基因表達水平，能譜分析細胞基質(zhì)成分，Micro-CT掃描和組織切片染色考察表面修飾納米管的種植體在體內(nèi)促成骨效應(yīng)。2.流式細胞儀檢測不同材料表面細胞周期變化，免疫印跡（Western blot）考察胞內(nèi)黏著斑激酶（FAK）、細胞骨架調(diào)控蛋白（RhoA）表達水平，BrdU測定黏著斑激酶活性抑制劑、細胞骨架調(diào)控蛋白抑制劑C3及其效應(yīng)因子（Rock）抑制劑Y27632對細胞增殖能力的影響，非線性回歸分析評估各調(diào)控

5、蛋白表達水平與細胞增殖的相關(guān)關(guān)系。3. Western blot考察不同材料表面細胞PYK2及p-PYK2蛋白表達水平，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因過表達模型，siRNA干擾建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因敲減模型，Real-time PCR檢測不同細胞模型的成骨相關(guān)基因表達水平。4. Image J軟件計算分析相同單位面積內(nèi)的細胞可粘附區(qū)域差異；激光共聚焦顯微鏡觀察YAP亞細胞分布；免疫共沉淀法考察細胞

6、黏著斑內(nèi) FAK募集水平差異；免疫 pull-down檢測 RhoA活性變化；免疫印跡法和熒光素酶測定法考察細胞核內(nèi)、外YAP表達差異；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立 YAP基因過表達細胞模型；Real-time PCR檢測RhoA活性增強、抑制，以及 YAP過表達對細胞成骨相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果：不同電壓制備出的二氧化鈦納米管管徑分別為40nm（STNTs）和150nm（LTNTs）。1.與光滑面純鈦（Flat Ti）相比，STNTs和 LTNTs表

7、面細胞伸展面積均減小（ P<0.05），形態(tài)長寬比均增大（P<0.05），其中LTNTs變化最為顯著（P<0.05）；培養(yǎng)1天時LTNTs組細胞增殖水平明顯高于其他組（P<0.05），7天時 STNTs和 LTNTs組均下降（P<0.05）。與Flat Ti相比，LTNTs和STNTs表面細胞分別在培養(yǎng)4天和21天時出現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達水平升高（P<0.05），其中 LTNTs組升高最為顯著（P<0.05）；能譜分析結(jié)果顯示 LTNTs

8、和STNTs組細胞基質(zhì)中均出現(xiàn)鈣元素；Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)植入14天時，大孔徑納米管修飾的種植體組周圍骨體積分數(shù)和骨小梁數(shù)量均明顯高于光滑面種植體組（P<0.05）。2. LTNTs組細胞培養(yǎng)1天時處于S期的細胞所占比例高于另外兩組（P<0.05）；LTNTs和STNTs組細胞中FAK、p-FAK和RhoA表達水平均明顯低于Flat Ti組（P<0.05），且下降程度以LTNTs組最為顯著（P<0.05），但該組細胞的R

9、hoA/FAK相對蛋白水平較另外兩組顯著升高（P<0.05）；LTNTs組細胞在加藥黏著斑激酶抑制劑PF573228培養(yǎng)1天時增殖能力仍然最高（P<0.05），RhoA活性抑制劑 C3以及 C3+PF573228同時加藥后比例均顯著下降（P<0.05），Rock抑制劑Y27632加藥后增殖能力顯著低于Flat Ti組（P<0.05）；與MC3T3-E1細胞在不同材料表面增殖能力相關(guān)性最大的指標為RhoA/FAK相對蛋白表達水平(P=0.

10、0017)。3. LTNTs組PYK2和p-PYK2表達較Flat Ti組和STNTs組顯著下降（P<0.05）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FAK、PYK2及FAK+PYK2過表達基因后，細胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達水平較對照組明顯增高（P<0.05）；siRNA對 FAK、PYK2及FAK+PYK2進行基因敲減后，細胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達水平較對照組明顯減低（P<0.05）；LTNTs表面PYK2過表達細胞的成骨相關(guān)基因表達水平顯著低于對照組（

11、P<0.05）。4.三種材料表面的細胞可粘附區(qū)域的面積、黏著斑內(nèi)FAK募集水平、GTP-RhoA表達水平及YAP胞核內(nèi)表達量隨納米管管徑增加而遞減（P<0.05）；Flat Ti表面細胞充分伸展時，黏著斑及細胞骨架纖維數(shù)目多、分布廣，STNTs上細胞伸展面積縮小時黏著斑與細胞骨架纖維數(shù)目減少，僅在細胞周邊局部區(qū)域可見；LTNTs表面細胞周邊黏著斑與骨架纖維進一步減少，僅分布于絲狀偽足凸起處；PF573228加藥后胞內(nèi)活性RhoA（GTP

12、-RhoA）表達量下降（P<0.05）；C3加藥后成骨相關(guān)基因表達明顯升高（P<0.05）；細胞在LTNTs表面過表達YAP或加入RhoA活性增強劑CN01后，胞核內(nèi)YAP分布增加，成骨相關(guān)基因表達明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：本實驗成功制備出兩種孔徑的納米管；1.與Flat Ti相比，STNTs表面細胞面積減小，形態(tài)伸長，呈現(xiàn)一定的成骨向分化能力；LTNTs表面細胞伸展面積進一步縮減，形態(tài)趨于梭形，細胞生長水平隨時間遞減，但在培養(yǎng)早

13、期具備較高的增殖能力，體內(nèi)與體外實驗均證實其具備較高的促成骨效應(yīng)。2. LTNTs對細胞早期增殖有促進作用，當其拓撲結(jié)構(gòu)抑制細胞內(nèi)FAK表達水平時，細胞骨架蛋白調(diào)控因子RhoA相關(guān)信號通路對其增殖能力的維持或促進發(fā)揮重要影響作用。3. LTNTs表面細胞內(nèi)FAK及PYK2蛋白表達同時受到抑制，但PYK2的低水平表達對細胞成骨向分化有正向調(diào)控作用。4. LTNTs拓撲結(jié)構(gòu)為細胞提供的可粘附面積較Flat Ti和STNTs表面顯著減小，MC

14、3T3-E1細胞在其表面粘附面積受限，黏著斑內(nèi)FAK募集水平下降，黏著斑與細胞骨架形成障礙，RhoA活性減低，YAP亞細胞分布集中在細胞漿，細胞成骨向分化能力高，從亞細胞水平驗證YAP作為FAK/RhoA機械傳導通路的下游信號因子對大孔徑納米管表面細胞形態(tài)改變及成骨向分化行為有重要調(diào)控作用。
　　本實驗通過觀察不同納米管管徑對細胞生物學行為的影響，針對納米管表面細胞形態(tài)、增殖及分化的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路及其相互之間的關(guān)系進行研究，為篩