DAG-PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分裂調(diào)控的重要信號(hào)通路之一，并廣泛分布于各種組織細(xì)胞。本研究工作觀察了Ley寡糖及PEMT2過(guò)表達(dá)對(duì)DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控作用。 Ley寡糖對(duì)DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控作用的研究哺乳動(dòng)物胚胎著床是生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及胚胎與子宮之間所發(fā)生的同步協(xié)調(diào)的一系列變化。 核酸和蛋白質(zhì)的合成均需模板來(lái)決定其核苷酸或氨基酸的排列順序

2、，而糖鏈的合成卻沒有模板，它是由一系列具有高度特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用來(lái)完成。巖藻糖化寡糖的合成是由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltranferases，F(xiàn)UTs)催化的。因此，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可能是這些巖藻糖基化寡糖抗原合成及其表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵。目前發(fā)現(xiàn)11種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，小鼠主要表達(dá)FUT1，2，4,7，8，9共6種功能性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其余為假基因。其中FUT1和FUT4參與Ley寡糖的合成，F(xiàn)UT7參與sLex寡糖的合成

3、，而FUT9是Lex寡糖合成所必需的。本室前期的研究工作觀察了部分FUTs在著床過(guò)程中的表達(dá)及調(diào)控，但FUTs家族在小鼠胚胎著床過(guò)程中的表達(dá)譜變化尚不清楚。 進(jìn)一步探討Ley寡糖的作用機(jī)制，采用共價(jià)連接Ley寡糖的瓊脂糖小球模擬胚胎與人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共孵育，觀察了Ley寡糖對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞(JEC細(xì)胞)膜蛋白中存在Ley寡糖的特異性結(jié)合蛋白或稱之為L(zhǎng)

4、ey寡糖受體。Ley寡糖通過(guò)與此受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以促進(jìn)胚胎著床。為尋找此蛋白，分別采用親和層析及親和吸附沉淀技術(shù)對(duì)JEC細(xì)胞膜蛋白中的Ley寡糖特異性結(jié)合蛋白進(jìn)行分離純化，并采用SDS-PAGE和Westernblot技術(shù)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。 PEMT2過(guò)表達(dá)對(duì)DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控作用的研究磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶2的作用是催化磷脂酰乙醇胺甲基化生成磷脂酰膽堿。該酶在肝外組織活性極低，主要分布于

5、正常肝組織。一般認(rèn)為，肝細(xì)胞合成PC的主要途徑是CDP—膽堿途徑，PE甲基化途徑只是作為CDP-膽堿途徑的補(bǔ)充。但研究發(fā)現(xiàn)，pemt2基因的表達(dá)與肝細(xì)胞的增殖分裂呈負(fù)相關(guān)。增殖快的細(xì)胞如肝癌細(xì)胞、再生肝組織中PEMT2表達(dá)量很低，而正常肝細(xì)胞中PEMT2的表達(dá)活性較高。轉(zhuǎn)染pemt2-cDNA可抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，一些作者把PEMT2看作是肝細(xì)胞特異的抑癌蛋白。在前期工作中，我們將pemt2-cDNA插入含有neo抗性

6、基因的pLNCX表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建了pLNCX-pemt2重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染入大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PEMT2過(guò)表達(dá)抑制大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但其機(jī)制不明。已知，細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分裂和癌變是受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精確調(diào)控的，為探討PEMT2過(guò)表達(dá)抑制大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們重點(diǎn)研究了轉(zhuǎn)染pemt2基因?qū)Υ笫蟾伟〤BRH-7919細(xì)胞二脂酰甘油(DAG)/蛋白激酶C(PKC)信

7、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，從而揭示PEMT2過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制. DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)是細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、分化、腫瘤的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)、細(xì)胞凋亡及代謝調(diào)控的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。PKC是這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子。PKC有多種亞型，不同的PKC亞型其功能、在組織中分布不同，其活性調(diào)節(jié)機(jī)制也不同。肝細(xì)胞中主要表達(dá)cPKCα、cPKCβ和nPKCε等亞型。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot技術(shù)，我們

8、觀察了轉(zhuǎn)染pemt2對(duì)CBRH-7919細(xì)胞不同亞型PKC表達(dá)和轉(zhuǎn)位的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pemt2可顯著抑制cPKCα的表達(dá)，促進(jìn)cPKCβ2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)cPKCβ2由胞漿向胞膜移位。而轉(zhuǎn)染pemt2對(duì)cPKCβ1和nPKCε的表達(dá)無(wú)顯著影響。 總之，轉(zhuǎn)染pemt2基因可抑制cMet的表達(dá)和激活，其結(jié)果使PLCγ1磷酸化活化受到抑制，細(xì)胞內(nèi)DAG生成減少，從而使PKCα活性降低，這可能是PEMT2過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增