一種Ly-6超家族新成員—鱖魚Lypn的研究.pdf

1、鱖魚是我國重要的魚類養(yǎng)殖品種，而近年來傳染性脾腎壞死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)對鱖魚養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研究病毒與宿主的相互作用，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了ISKNV感染鱖魚的抑制性消減雜交cDNA文庫基礎(chǔ)。本論文針對一個(gè)Ly-6超家族成員的cDNA進(jìn)行了進(jìn)一步研究。 序列分析。該cDNA含有一個(gè)282bp的開放閱讀框，編碼93個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為

2、10.3kDa,等電點(diǎn)為5.15。其中N端19個(gè)氨基酸殘基為信號肽，成熟蛋白由74個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測分子量為8.2kDa，等電點(diǎn)為5.05。通過生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有Ly-6/uPAR樣結(jié)構(gòu)域，即以亮氨酸或異亮氨酸為N端開始，具有8-10個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Ly-6SF的家族成員。預(yù)測定位于細(xì)胞外，無GPI錨定信號，為分泌型蛋白。從系統(tǒng)進(jìn)化的距離，基因的結(jié)構(gòu)，以及蛋白三維結(jié)構(gòu)的同源建模來看，該蛋白跟Ly-6SF的一個(gè)重要

3、成員CD59具有很大的相似性。猜測可能具有補(bǔ)體調(diào)節(jié)的功能。因此，我們將其命名為Lypn(Ly-6/protectin)。 基因全長的克隆。用反向PCR方法克隆了該基因的全長，lypn基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，上游側(cè)翼區(qū)域含有幾個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如AP-1，NF-KappaB，V-Mvb和GATA-1等。這些轉(zhuǎn)錄因子多跟血細(xì)胞的分化、增殖密切相關(guān)。 基因在ISKNV感染后的表達(dá)譜。用半定量RT-PCR研究了l

4、ypn基因在ISKNV感染鱖魚后的不同時(shí)段、不同組織內(nèi)的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在健康情況下，Lypn可在鱖魚脾臟和血細(xì)胞中表達(dá)，而在心、肝、頭腎、后腎、腦、鰓和卵巢中則檢測不到。鱖魚在ISKNV感染后的第4天，心、肝、脾、頭腎、后腎、腦、腮和卵巢等組織均無法檢測到Lypn的表達(dá)；第11天，在肝、鰓和卵巢出現(xiàn)了較弱的表達(dá)條帶；第15天時(shí)，鱖魚處在ISKNV感染后的康復(fù)階段，Lypn在肝、脾、頭腎、后腎、腦和卵巢均有表達(dá)。 重組蛋白的

5、表達(dá)。為了研究其功能，及尋找與其相互作用的蛋白質(zhì)，我們進(jìn)行了Lypn的重組表達(dá)。分別以pMal-c2x和pGEX-4T-1質(zhì)粒為載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMal-lypn和pGEX-lypn，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)菌，獲得了目的蛋白的表達(dá). 活性測定模型的構(gòu)建。我們從補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑出發(fā)構(gòu)建了鱖魚補(bǔ)體溶破紅細(xì)胞系統(tǒng)模型，為研究Lypn是否具有抑制補(bǔ)體的活性奠定了基礎(chǔ)。 上述研究結(jié)果，表明lypn基因的表達(dá)在ISKNV感染后