枯草芽孢桿菌B44、B4菌株的培養(yǎng)條件及B44所產(chǎn)生抗真菌蛋白的研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B44、B4菌株是從小麥根際土壤中分離得到的。經(jīng)測定，兩種枯草芽孢桿菌對棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌和小麥全蝕病菌4種植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用[1]。為了進(jìn)一步研究兩種生防菌株的有效成份，本文通過研究確定了枯草芽孢桿菌（B.subtilis）B44、B4兩種菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件和確認(rèn)了發(fā)酵粗提液對24種植物病原真菌的抑制作用;并從B44菌株發(fā)酵液中分離得到了抗菌蛋白，研究

2、了其性質(zhì)，對今后純化該物質(zhì)和應(yīng)用研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 采用不同的培養(yǎng)基、不同PH值、不同的溫度、不同的通氧量、不同的發(fā)酵時間對B44、B4兩種菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵液的抑菌活性，得到了兩種菌株產(chǎn)生抗菌蛋白的最佳條件:(1)B44菌株:在pH值為7的Wakimoto's培養(yǎng)基中，以30℃的溫度、裝液量為90ml，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min震蕩培養(yǎng)24h可得到大量的抗菌蛋白;(2)B4菌株:在pH值為8的Wakimot

3、o's培養(yǎng)基中，以30℃的溫度、裝液量為70ml，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min震蕩培養(yǎng)48h可得到大量的抗菌蛋白。
　　 采用上述的培養(yǎng)條件，用環(huán)柱測定法測定了B44和B4菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白粗提液對小麥全蝕病菌和蘋果輪紋病菌等24種植物病原真菌的抑制作用，檢測結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌B44菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白的抑菌效果要比B4菌株產(chǎn)生的好，故在以后的試驗(yàn)過程中主要以B44產(chǎn)生的抗菌蛋白為主要研究對象。將B44菌株進(jìn)行盆栽抑菌試驗(yàn)，抑菌

4、結(jié)果較好，抑菌效果達(dá)50％以上。
　　 枯草芽孢桿菌（B.subtilis）B44菌株發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，經(jīng)80％飽和硫酸銨沉淀，茚三酮檢測，顯色為淡紫色，初步確認(rèn)所產(chǎn)生的抗菌蛋白含有多肽或蛋白質(zhì)或氨基酸。產(chǎn)生的沉淀經(jīng)過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種有機(jī)溶劑進(jìn)行液液分配萃取后，發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)主要存留在水層，對水層物質(zhì)進(jìn)行透析、脫鹽。將粗提物進(jìn)行ODS-C18反相硅膠柱層析，分別用30％、50％、80％的甲醇水溶液做梯度洗脫。活性