進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子結(jié)合特性研究.pdf

1、免疫球蛋白結(jié)合分子(Ig-binding proteins,IBP)是一類表達(dá)于細(xì)菌表面的能與宿主免疫球蛋白特定部位結(jié)合的蛋白，能調(diào)節(jié)宿主對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)，是細(xì)菌重要致病因子之一。研究最多的IBP主要有3種：金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA,SpA)、鏈球菌(C和G群)蛋白G (Streptococcal protein GSpG) 和部分大消化鏈球菌表面的蛋白L (Peptostreptococcu

2、s magnus protein L,PpL)。這三種IBP分子的胞外部分均含由若干重復(fù)的序列高度同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在Ig結(jié)合特性上，這三種分子均具有各自的特點(diǎn)和局限。因此，通過對(duì)這三種分子進(jìn)行重組，獲得具有新的結(jié)合活性的重組IBP分子，已成為IBP研究的方向之一。 在以前的研究中，我們將SpA和PpL的單個(gè)Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域DNA片段隨機(jī)拼接，再應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)將這些拼接后的分子表達(dá)于噬菌體表面，構(gòu)建了SpA和PpL的單結(jié)

3、構(gòu)域隨機(jī)組合分子噬菌體展示文庫。以人Ig(包括IgG、IgA、IgM及IgE)為誘餌對(duì)文庫進(jìn)行親和篩選，得到了一類篩選后文庫中的優(yōu)勢(shì)克隆，即由PpL的B3結(jié)構(gòu)域與SpA的D、A、B、C結(jié)構(gòu)域(主要為D)間隔排列組成的新型進(jìn)化IBP形式(MDPL-MDPA)n。由于VH3重鏈和K輕鏈在IgG、IgA、IgM及IgE上均有分布，因此，我們推斷，B3結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域的間隔排列使該類分子具有對(duì)Ig的VH3重鏈和K輕鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合，從而使親和力明

4、顯提高而成為優(yōu)勢(shì)克隆。為驗(yàn)證我們提出的這一推斷，本課題以LD3和LD5作為(MDPL-MDPA)n結(jié)構(gòu)形式的代表分子，對(duì)LD3/5分子對(duì)各類Ig和Ig片斷及scFv進(jìn)行結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)比較LD3／5與SpA和PpL的差異，并應(yīng)用SPR技術(shù)對(duì)LD3/5結(jié)合各類Ig的動(dòng)力學(xué)和親和性進(jìn)行研究，證實(shí)了進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD3/5具有對(duì)V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)協(xié)同結(jié)合特性。 一、(MDPL-MDPA)n分子的結(jié)合特性的定

5、性和定量研究 本課題以LD3和LD5作為(MDPL-MDPA)n的代表性分子，首先對(duì)LD3/5進(jìn)行原核表達(dá)和純化。SpA和4L(由四個(gè) PpL的B3結(jié)構(gòu)域組成)作為L(zhǎng)D3/5的來源蛋白，用作結(jié)合特性的對(duì)照和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)物。 人IgG以木瓜蛋白酶切獲得Fab、Fc，對(duì)Fab、Fc及IgG、IgM、IgA及LD5蚩白進(jìn)行生物素標(biāo)記。三種scFv的表達(dá)質(zhì)粒由荷蘭Sanquil實(shí)驗(yàn)室Dr．Jan Voorberg提供，將

6、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TG1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 以相同量的LD3、LD5、4L、SpA包板，用生物素標(biāo)記的IgG、IgM、IgA及Fab、Fc分別進(jìn)行結(jié)合EIASA。結(jié)果表明，對(duì)IgG的結(jié)合性，SpA>LD5<'-> LD3>4-L；對(duì)Fc的結(jié)合性，SpA>LD5>LD3，4L不結(jié)合；而對(duì) IgM、IgA 和Fab的結(jié)合性則呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，即LD5>LD3>4L>SpA。由于IgM、Ign和Fab抗體結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是都具有V<,H>3重鏈和κ輕

7、鏈，而均沒有可以與IBP分子結(jié)合的Fc段，因此可以看出，LD3/5相對(duì)于SpA和4L的結(jié)合優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在與含有V<,H>3和V<,κ>位點(diǎn)的Fab的結(jié)合上，而對(duì)IgG-Fc的親和性并無增高。這一結(jié)果支持我們的推斷即 LD3/5具有對(duì)Ig的V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)結(jié)合特性，但由于以上的IgM、IgA和Fab均為血清多克隆組成，含有多種V<,H>基因和輕鏈型別的組合，因此這一結(jié)果不能成為V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)結(jié)合的直接證據(jù)。通

8、過Western Blot和Dot Blot的方法對(duì)EILSA的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。在Western Blot中，以相同量的LD3、LD5、4L、SpA進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后與生物素標(biāo)記的各種Ig結(jié)合，發(fā)現(xiàn)對(duì)LD3、LD5、4L、SpA對(duì)IgG、Fab、Fc的結(jié)合強(qiáng)弱關(guān)系與ELISA一致，而在對(duì)IgM、IgA的結(jié)合上，LD3/5的結(jié)合優(yōu)勢(shì)不明顯，可能由于SDS-PAGE電泳過程和膜固相化改變了蛋白的構(gòu)象，使LD3/5的結(jié)合特性受影響。

9、在Dot Blot實(shí)驗(yàn)中，以相同量的LD3、LD5、4L、SpA及BSA點(diǎn)膜，與生物素標(biāo)記的各種Ig結(jié)合。結(jié)果與Western Blot相似。 基因工程scFv抗體具有單一的VH基因和輕鏈型別的組合，我們獲得了三種scFv抗體，KM36 (V<,H>3-V<,λ>3)、KM38(V<,H>3-V<,κ>Ⅰ)和KM41(V<,H>1-V<,κ>Ⅲ)，用這三種scFv抗體包板，與生物素標(biāo)記的LD5結(jié)合，結(jié)果顯示LD5對(duì)這三種scF

10、v的親和性KM38>KM41>KM36。用這三種scFv抗體以生物素標(biāo)記的LD5進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，得到與ELISA同樣的結(jié)果。該結(jié)果為L(zhǎng)D3/5分子對(duì)V<,H>3和V<,κ>雙位點(diǎn)結(jié)合特性提供了直接證據(jù)。 我們應(yīng)用SPR技術(shù)對(duì)LD3、LD5、4L、SpA與Ig結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和親和力進(jìn)行了定量分析，測(cè)定了LD3/5及4L、SpA對(duì)各種Ig分子的結(jié)合率常數(shù)k<,a>，解離率常數(shù)k<,d>及平衡解離常數(shù)K<,D>，本實(shí)

11、驗(yàn)在復(fù)旦大學(xué)遺傳所使用 Biacore3000儀器進(jìn)行。以IgG、IgM、IgA分別標(biāo)記芯片，與LD3、LD5、4L、SpA分別結(jié)合，BIAevaluation 3.0軟件分析結(jié)果，從得到的K<,D>看出，LD3/5對(duì)IgM和IrA的親和性較4L高出1到8倍，較SpA則優(yōu)勢(shì)更明顯。且對(duì)IgM比對(duì)IgA的結(jié)合優(yōu)勢(shì)更為明顯，與ELISA結(jié)果一致。該結(jié)果對(duì)LD3/5的結(jié)合特性分析提供了定量的支持。 二、LD3/5、4L、SpA結(jié)合各

12、類Ig分子的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明LD3/5分子與4L和SpA相比，具有對(duì)Ig-Fab的高親和性。而這種現(xiàn)象可有兩種解釋，一是LD3/5對(duì)V<,H>3和V<,κ>兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的單純相加效應(yīng)，這種效應(yīng)的結(jié)合應(yīng)該能被4L和SpA的聯(lián)合所有效的抑制；另一種解釋，即本課題所提出的科學(xué)推斷，LD3/5分子具有對(duì)V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)結(jié)合協(xié)同增強(qiáng)機(jī)制，從而使LD3/5對(duì)Ig-Fab的親和性明顯提高，而4L和SpA聯(lián)合不

13、能有效的抑制這種協(xié)同作用。因此，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，是本課題驗(yàn)證LD3/5 對(duì) V<,H>3和V<,κ>雙位點(diǎn)結(jié)合的關(guān)鍵所在。 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)以兩種方案進(jìn)行，分別是以IBP分子包板和以Ig分子包板。在第一種方案中，以生物素標(biāo)記的Ig和各種抑制蛋白(4L、LD3、LD5、SpA、4L+SpA)先作用，再移入4L、LD3、LD5、SpA包被條排孔反應(yīng)；另一種方案則用lg分子包板，同時(shí)加入生物素標(biāo)記的LD5和各種抑制蛋白反應(yīng)。這兩種競(jìng)

14、爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，LD3/5能有效的抑制4L對(duì)IgM、IgA、IgG-Fab的結(jié)合和SpA對(duì)IgG和Fc的結(jié)合，LD3/5能100％的抑制自身對(duì)IgM、IgA、IgG-Fab的結(jié)合，而更為重要的是，4L和4L+SpA在與LD3/5相同的濃度下只能抑制 50％-60％的LD3/5對(duì)IgM、IgA、IgG-Fab的結(jié)合，且繼續(xù)升高4L和4L+SpA的濃度，抑制百分比無明顯變化。這一結(jié)果有力的說明了LD3/5對(duì)IgM、IgA、IgG-Fab

15、的V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)結(jié)合協(xié)同作用。 在LD5結(jié)合scFv的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，雖然LD5對(duì)KM38的親和性較KM36和KM41高，但LD5對(duì)KM38的結(jié)合卻能有效地被4L及4L+SpA抑制。我們認(rèn)為，由于基因工程scFv的V<,H>和V<,L>區(qū)是以連接肽相連，其V<,H>-V<,L>異二聚體的構(gòu)象與天然Ig不同，使LD3/5對(duì)V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)結(jié)合不能有效實(shí)現(xiàn)。這也說明了雙位點(diǎn)結(jié)合對(duì)抗體構(gòu)象的嚴(yán)格要求

16、。 結(jié)論：本課題應(yīng)用ELISA、Western Blot、Dot Blot和SPR等方法證實(shí)了新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD3/5具有對(duì)IgG-Fab、IgM和IgA明顯提高的親和性，并且首次證實(shí)了由PpL的B3結(jié)構(gòu)域和SpA的D結(jié)構(gòu)域間隔重組的LD3/5分子具有對(duì)V<,H>3和V<,κ>的雙位點(diǎn)協(xié)同結(jié)合特性。這類分子在免疫抗體檢測(cè)方面具有應(yīng)用前景，將提高對(duì)IgM、IgA的檢測(cè)敏感性，有助于HIV、HCV等重大傳染病的早期診斷