截短型PF4慢病毒載體的構(gòu)建及抗血管新生活性研究.pdf

1、截短型截短型PF4慢病毒載體的構(gòu)建病毒載體的構(gòu)建及抗血管新生抗血管新生活性研究活性研究ConstructionofdPlateletFact4LentiviralVectStudyonAntiangiogenesisActivity學(xué)科專業(yè)：生物工程研究生：王聽月指導(dǎo)教師：黃鶴副教授企業(yè)導(dǎo)師：王大梅正高級工程師天津大學(xué)化工學(xué)院二零一五年六月摘要摘要血管新生對于實(shí)體瘤的生長與轉(zhuǎn)移是一個(gè)關(guān)鍵步驟，抑制腫瘤血管的生成可以達(dá)到抑制腫瘤生長的目的

2、，因此以腫瘤血管新生為靶點(diǎn)的治療策略逐漸發(fā)展成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。血小板因子4（plateletfact4，PF4）是一種內(nèi)源性抗血管生成因子，它通過多種機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，以此抑制血管生成。慢病毒載體作為一種常用且研究較多的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，以其能轉(zhuǎn)染較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織，將治療基因安全有效的整合到靶細(xì)胞基因組中，目的基因表達(dá)穩(wěn)定持久、轉(zhuǎn)移基因容量較大等優(yōu)勢，在基因治療中扮演重要角色。隨著研究的深入，慢病毒載體在腫瘤基因治

3、療方面也取得了很大進(jìn)展。本課題構(gòu)建了攜帶截短型血小板因子4片段——PF44770RGD的慢病毒表達(dá)載體，將其包裝為活性病毒，并以其介導(dǎo)的PF44770RGD為研究對象，探討其體外抑制血管新生的生物學(xué)活性，為抗血管生成基因療法治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。本研究首先將血小板因子4片段PF44770RGD，從保存的載體pcDNA3.1()PF44770RGD上擴(kuò)增出來，然后將其插入慢病毒表達(dá)載體pLVMCSBsd中，構(gòu)建出慢病毒表達(dá)載體pLVPF44

4、770RGD。其次，將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體連同慢病毒包裝系統(tǒng)的三個(gè)輔助質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝生產(chǎn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RealtimeQuantitativePCR，QPCR)測定收獲病毒的滴達(dá)6.16107IUml。再次，將獲得的空載慢病毒（pLVMCSBsd）和重組慢病毒(pLVPF44770RGD)分別感染人肺腺癌A549細(xì)胞系，在殺稻瘟菌素（Blasticidin，Bsd）壓力下篩選出對應(yīng)的穩(wěn)定表達(dá)

5、細(xì)胞系，然后在基因水平上通過RTPCR，蛋白水平上通過WesternBlot來檢測PF44770RGD重組肽的表達(dá)。最后，進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)，研究重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PF44770RGD基因功能及感染的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的重組肽的功能，即收集病毒顆粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)PF44770RGD的A549細(xì)胞的培養(yǎng)液，用MTT法檢測對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的作用，并觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)PF44770RGD的A549細(xì)胞培養(yǎng)液對HUVEC小管形成的影響。結(jié)果