溫度脅迫下番茄葉綠體甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因的功能分析.pdf

1、低溫是限制冷敏感植物產(chǎn)量和地理分布的重要因素。生物膜是低溫傷害的初始位點。植物的抗冷性與膜脂中脂肪酸的不飽和程度密切相關(guān)。由于葉綠體中磷脂酰甘油(PG)的sn-2位主要被飽和脂肪酸或反式不飽和脂肪酸所占據(jù)，因而PG在sn-1位的順式不飽和脂肪酸水平?jīng)Q定了植物的抗冷性。決定PG中sn-1位順式不飽和脂肪酸含量的是葉綠體甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT:EC2.3.1.15)對底物的選擇性。GPAT是PG生物合成過程中的第一個酰基脂化酶，

2、它將脂肪酰轉(zhuǎn)移到3一磷酸甘油的sn-1位上合成1-?；?Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)。來源于抗冷性不同的植物的GPAT對底物?；哂胁煌倪x擇性。一般來說，抗冷植物中GPAT優(yōu)先選擇C18:1-ACP作為底物，因此在這些植物中PG的sn-1位上就含有較高比例的18：1脂肪酸，這些脂肪酸可以在?；舅崛ワ柡兔傅淖饔孟逻M一步去飽和化成為順式多聚不飽和脂肪酸；然而在冷敏感植物中，GPAT很難區(qū)分C18：1-ACP和C16:0-ACP，

3、由于16:0脂肪酸不能被進一步去飽和形成順式不飽和脂肪酸，結(jié)果這些植物中PG的sn-2位順式不飽和脂肪酸含量較低，從而表現(xiàn)為冷敏感。 本研究從番茄葉片中分離到葉綠體甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因，并對該基因的表達和功能進行了分析。主要結(jié)果如下： 1．利用同源序列設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因的中間片段，通過5’-RACE和3'-RACE分別克隆到5’和3’片段，拼接后設(shè)計特

4、異引物擴增到全長cDNA，命名為LeGPAT(DQ459433)。該基因全長為1770 bp，ORF為1314 bp，編碼437個氨基酸，分子量約為48 kDa。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因的序列與甜椒、紅花、豌豆、菠菜的甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因的序列同源性較高。結(jié)構(gòu)同源性分析表明LeGPAT。有四個序列保守的結(jié)構(gòu)域，blockI的組氨酸和天冬氨酸殘基，blockⅢ的甘氨酸殘基和blockⅣ的脯氨酸殘基都是絕對

5、保守的，它們組成了一個重要的催化位點。 2．將p35S-LeGPAT-GFP融合蛋白在豇豆原生質(zhì)體中瞬時表達。通過Confocal觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeGPAT的基因產(chǎn)物定位于葉綠體。 3．Northern雜交分析顯示，LeGPAT在不同器官中呈非特異性表達，在葉綠素含量高的組織中表達量較高。同時，該基因在4-40℃的溫度范圍內(nèi)均有表達，且受低溫誘導，高溫脅迫抑制其表達。

6、 4．將獲得的LeGPAT與含有35S啟動子的pBl121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，用PCR和Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進一步檢測，獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比，過量表達LeGPAT的番茄葉片類囊體膜PG中18：2和18：3含量明顯增加，脂肪酸不飽和度升高，從而導致低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株類囊體膜的流動性高于野生型植株。LeGPAT表達發(fā)生沉默

7、的番茄植株中PG的18:2和18:3含量下降，而16:0，16:1和18:0含量增加，脂肪酸飽和度升高。 5．構(gòu)建了原核表達載體pET-LeGPAT，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，免疫小白鼠，制備抗體，其抗血清效價為1：500。Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義植株中LeGPAT已在蛋白水平過量表達。 6．將野生型和轉(zhuǎn)正義基因番茄的酶提取液，以及原核表達后純化的蛋白分別與[1-<'14>C]18:1-CoA，[1-<'

8、14>C]16：0．CoA，甘油-3-磷酸，HEPES-NaOH緩沖液和BSA反應測定甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶的選擇性和該酶的活性。結(jié)果表明，盡管番茄是冷敏感植物，但甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶對18：1的選擇性明顯高于16:0，且轉(zhuǎn)正義基因番茄的酶含量和總活性高于野生型。 7．在低溫弱光(4℃，100 μmaol m<'-2>s<'-1>)脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)正義基因株系T<,1>-5和T<,1>-19的光合速率(Pn)都降低，

9、但野生型的降低較明顯，并且T<,1>-5和T<,1>-19的Pn可以在12 h內(nèi)恢復，而野生型的Pn在12 h時僅恢復了73.2％，在24 h時恢復了86.4％。在低溫脅迫過程中，T<,1>-5和T<,1>-19的光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)降低的程度比野生型小，而且恢復較快，恢復8 h時T<,1>-5和T<,1>-19的Fv/Fm完全恢復，但此時野生型的Fv/Fm只恢復了95.2％。在低溫弱光處理過程中，轉(zhuǎn)正義基因植株與野生型

10、的氧化態(tài)P700都降低，且區(qū)別不大，而轉(zhuǎn)正義基因植株的氧化態(tài)P700恢復較快。經(jīng)過24 h的恢復，T<,1>-5的氧化態(tài)P700恢復了98.5％，T<,1>-19的恢復了99.4％，而野生型的只恢復了85.3％：經(jīng)過12 h的低溫脅迫，T<,1>-5和T<,1>-19的相對電導率分別增加到21.3％和19.3％，而野生型的增加到24．4％。轉(zhuǎn)正義基因植株和野生型的NPQ及(A+z)/(V+A+z)都增加，但轉(zhuǎn)正義基因植株的NPQ和(A+

11、Z)/(V+A+z)增加的較多。野生型番茄的葉綠體SOD和APX活性在脅迫的最初6 h升高，隨后降低，而轉(zhuǎn)正義基因植株的葉綠體SOD和APX活性在處理9 h后才輕微的降低。低溫處理6 h后，轉(zhuǎn)正義基因植株的SOD和APX活性高于野生型。野生型番茄的O<,2>和H<,2>O<,2>的含量在低溫處理6 h后開始增加，而轉(zhuǎn)正基因植株的O<,2>和H<,2>O<,2>含量在處理9 h后才增加，而且野生型的O<,2>和H<,2>O<,2>含量增加

12、的程度明顯高于轉(zhuǎn)基因植株。脅迫結(jié)束時，T<,1>-5，T<,1>-19和野生型的O<,2>含量分別增加了15.7％，14.8％和63.0％，而H<,2>O<,2>含量分別增加了26.0％，15.8％和77.6％。 8．反義介導的LeGPAT的缺失能夠影響番茄的育性。從形態(tài)上看，轉(zhuǎn)反義基因株系(-)12的花粉粒大部敗育。(-)12株系從小孢子母細胞時期絨氈層開始敗育，在單核小孢子液泡期敗育的花粉粒明顯高于野生型。反義介導的LeGP

13、AT的缺失能夠減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成，改變油脂的大小。當花粉粒在培養(yǎng)基上萌發(fā)60 min后，野生型的花粉有65％的萌發(fā)，而轉(zhuǎn)反義基因株系(-)12的花粉僅有8％的萌發(fā)。當花粉粒在培養(yǎng)基上萌發(fā)120 min后，野生型花粉的萌發(fā)率幾乎為100％，而(-)12株系的僅為20％。轉(zhuǎn)反義基因株系(-)12中53.8％(14/26)的花敗育，而野生型植株中僅有7.8％(4/51)的花敗育。轉(zhuǎn)反義基因植株的種子敗育，失去再生能力，而野生型的種子發(fā)育正常。

14、 9．在高溫弱光脅迫(45℃，100μmol m<'-2>s<'-1>)下處理6 h和12 h，野生型和轉(zhuǎn)反義基因番茄的放氧速率都降低，但野生型降低的比較明顯。45℃處理6 h后，野生型，(-)7和(-)12株系的放氧速率分別降低到初始值的30.5％，47.4％和50.9％；12 h時分別降低到7.2％，18.5％和19.4％。高溫脅迫過程中，野生型和轉(zhuǎn)反義基因番茄的Fv/Fm都降低，但野生型降低的比較明顯。45℃下處理12 h，