結(jié)核易感標(biāo)志物和血清標(biāo)志物的研究.pdf

1、結(jié)核病，是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起并經(jīng)呼吸道傳播的一種慢性傳染病，嚴(yán)重的危害人類健康。病原菌主要侵入人體的肺部，以肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，PTB）最為常見。近年來，由于人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）流行、藥物的濫用導(dǎo)致MTB耐藥的出現(xiàn)，再加上人們對結(jié)核菌并沒有引起足夠重視，使得世界范圍內(nèi)的結(jié)核病

2、又死灰復(fù)燃。盡管全球通過擴(kuò)展直接觀察與短程治療戰(zhàn)略及投入大量的資金來提高結(jié)核病治療的完成率，但低下的疾病病例檢出率仍然是結(jié)核病控制的主要障礙，導(dǎo)致結(jié)核病成為發(fā)病率和死亡率最高的感染性疾病之一。提高病人的檢出率并及時(shí)治療病人是有效控制結(jié)核病傳染源，遏制結(jié)核病流行的最重要措施。目前臨床上結(jié)核病的診斷方法有多種，都由于各種原因都無法滿足臨床上輔助診斷與指導(dǎo)用藥的需要，因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)病人和結(jié)核病的有效防控。
　　血

3、清中的蛋白具有非常重要的生理功能，主要包括參與人類機(jī)體的代謝、免疫、運(yùn)輸、物質(zhì)交換、信號調(diào)節(jié)、凝血作用。在病理狀態(tài)下血清中低豐度蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量通常會發(fā)生變化，因此這些具有重要生物學(xué)功能的表達(dá)量很低的蛋白質(zhì)對于疾病的監(jiān)測和診斷有著重要的意義。為了發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的血液標(biāo)志物，首先需要確定結(jié)核病人特別是肺結(jié)核病病人是否存在血液標(biāo)志物，因此，本研究第一部分針對近年來結(jié)核的易感標(biāo)志物研究進(jìn)行系統(tǒng)的文獻(xiàn)分析。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核的遺傳易感性是由多基因所決

4、定的，其中有關(guān)人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)等位基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的相關(guān)性備受關(guān)注。因此，通過對現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析從基因水平上確認(rèn)在血液中可以找到與結(jié)核病相關(guān)的易感性標(biāo)志物。
　　基因是遺傳信息的攜帶者，而生命活動的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì)，與易感性基因標(biāo)志物相比，蛋白質(zhì)標(biāo)志物可能與結(jié)核病的相關(guān)性更大。相對和絕對定量的同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and ab

5、solute quantitation，iTRAQ）標(biāo)記的基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）作為新學(xué)科及蛋白組學(xué)研究技術(shù)平臺，為發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病的血清標(biāo)志物提供了新思路，蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)讓人類能夠熟知細(xì)胞和生命有機(jī)體在特定時(shí)間和空間內(nèi)所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。因此

6、，本研究的第二和第三部分利用相對定量的蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證血清蛋白性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）、微管蛋白α-3E鏈（Tubulin alpha-3E chain，TBA3E）分別作為肺結(jié)核病和耐多藥肺結(jié)核病的有價(jià)值的候選標(biāo)志物。
　　第一部分結(jié)核病易感標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性分析
　　目的：采用Meta分析的方法對國內(nèi)外已發(fā)表的有關(guān)于HLA-DRB1、HLA-DQ基因多態(tài)性與

7、結(jié)核病易感性的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析，尋找結(jié)核病相關(guān)的易感基因。
　　方法：在PubMed和EMBASE中，應(yīng)用關(guān)鍵詞"Mycobacterium tuberculosis"、"tuberculosis"、"MTB"或"TB"、"HLA-DRB1"、"HLA-DQA1"或"HLA-DQB1"或"human leukocyte antigen"或"HLA antigen"、"Polymorphism"、"Polymorphisms"、或"

8、Genetic polymorphism"搜索1980年1月到2014年6月期間發(fā)表的相關(guān)英文文獻(xiàn)。應(yīng)用 Stata 版本 11.2軟件包對納入的研究結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：最終分別有21篇和12篇關(guān)于HLA-DRB1基因和HLA-DQ基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系的文獻(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)并納入研究。研究結(jié)果表明HLA-DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)（DRB1*15：OR=1.49

9、，95％CI：1.13-1.97，P=0.005；DRB1*08:03：OR=1.90，95%CI：1.25-2.90，P=0.003），而HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*11、DRB1*11:03和DRB1*12:02等位基因多態(tài)性降低結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)（DRB1*03：OR=0.82，95%CI：0.68-0.99，P=0.049；DRB1*11：OR=0.71，95%CI：0.54-0.93，P=0.013；DRB1*11:03

10、：OR=0.3，95%CI：0.1-0.4，P=0.028；DRB1*12:02:：OR=0.62，95%CI：0.39-0.98，P=0.043）。亞組分析結(jié)果表明DRB1*03和DRB1*07:01等位基因多態(tài)性會降低亞洲人群結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（DRB1*15：OR=0.78，95%CI：0.62-0.99，P=0.037；DRB1*07:01：OR=0.71，95%CI：0.53-0.95，P=0.020），而DRB1*15、DRB

11、1*08:03 和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加亞組人群結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（DRB1*15：OR=1.80，95%CI：1.48-2.20，P=0.000；DRB1*08:03：OR=1.91，95%CI：1.25-2.92，P=0.003）。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因多態(tài)性與結(jié)核病強(qiáng)相關(guān)，可能是其易感標(biāo)志物。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與

12、結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯的關(guān)聯(lián)。
　　第二部分 基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病血清潛在標(biāo)志物
　　目的：應(yīng)用相對定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選肺結(jié)核病與對照組血清中的差異表達(dá)蛋白并驗(yàn)證潛在標(biāo)志物，為肺結(jié)核病防控提供有價(jià)值的血清候選標(biāo)志物。
　　方法：采用相對和絕對定量的穩(wěn)定同位素(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標(biāo)記結(jié)

13、合MALDI-TOF-MS技術(shù)分析五組樣本的血清蛋白組，即7例耐多藥肺結(jié)核?。╩ulti-drug resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB）、30例涂陰肺結(jié)核?。╯mear-negative pulmonary tuberculosis，SNP-TB）、10例涂陽肺結(jié)核?。╯mear-positive pulmonary tuberculosis，SPP-TB）、30例健康對照和10例肺炎血清差

14、異表達(dá)蛋白；生物信息學(xué)分析差異蛋白的功能；對潛在標(biāo)志物SHBG蛋白表達(dá)水平進(jìn)行系列驗(yàn)證，包括應(yīng)用免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)驗(yàn)證40例肺結(jié)核病和10例對照組織，ELISA驗(yàn)證 24例健康對照、35例耐多藥肺結(jié)核病、55例涂陽肺結(jié)核病、70例涂陰肺結(jié)核病和15例肺炎的血清標(biāo)本，Western Blot驗(yàn)證30例健康對照、7例耐多藥肺結(jié)核病、10例涂陽肺結(jié)核病、30例涂陰肺結(jié)核病和10例肺炎的血清標(biāo)本。根據(jù)E

15、LISA的結(jié)果繪制受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)并分析相關(guān)指標(biāo)。
　　研究結(jié)果：相對定量蛋白組學(xué)共鑒定和篩選出肺結(jié)核病血清26個(gè)差異表達(dá)蛋白(包括16個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)和10個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá))。ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白在肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高（耐多藥肺結(jié)核病組：181.76±200.09 nmol/L、涂陽肺結(jié)核病組：160.43±75.45 nm

16、ol/L、涂陰肺結(jié)核病組：159.75±75.47 nmol/L、肺炎組：60.63±59.38 nmol/L、健康對照組：33.39±34.24 nmol/L；p<0.0001），IHC和Western Blot方法的驗(yàn)證結(jié)果也表明SHBG蛋白在肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高（p<0.05），三種驗(yàn)證方法的表達(dá)趨勢與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白鑒別肺結(jié)核病與肺炎、健康對照的準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性和AUC分別為78

17、.74%、75.6%、91.53%和0.981。
　　結(jié)論：建立蛋白組學(xué)篩選和鑒定肺結(jié)核病血清差異表達(dá)蛋白的技術(shù)平臺；血清SHBG蛋白鑒別肺結(jié)核病與肺炎、健康對照的具有較高準(zhǔn)確性、靈敏度和特異度；是肺結(jié)核病防控有價(jià)值的血清候選標(biāo)志物。
　　第三部分 基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核病血清潛在標(biāo)志物
　　目的：應(yīng)用相對定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選耐多藥肺結(jié)核病與對照血清中的差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步應(yīng)

18、用ELISA和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)技術(shù)驗(yàn)證潛在的標(biāo)志物。
　　方法：采用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)分析四組血清樣本的蛋白，包括7例耐多藥肺結(jié)核病、30例涂陰肺結(jié)核病、30例健康對照組和10例肺炎組，并通過Proteinpilot軟件篩選與鑒定耐多藥肺結(jié)核病相關(guān)的差異蛋白；應(yīng)用生物信息學(xué)分析顯著差異蛋白的細(xì)胞成分、分子功能和生物過程；對潛在標(biāo)志物TBA

19、3E、纖連蛋白(Fibronectin 1，F(xiàn)N1)和玻連蛋白（Vitronectin，VTN）的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，ELISA驗(yàn)證19例健康對照、15例肺炎、22例涂陰肺結(jié)核病和 13例耐多藥肺結(jié)核病血清標(biāo)本中TBA3E蛋白表達(dá)水平；以及26例健康對照、26例肺炎、25例涂陰肺結(jié)核病和 27例耐多藥肺結(jié)核病血清標(biāo)本中VTN表達(dá)水平；MRM技術(shù)驗(yàn)證蛋白VTN和FN1在10例健康對照、10例肺炎、10例涂陰肺結(jié)核病和10例耐多藥肺結(jié)核病血清

20、標(biāo)本表達(dá)水平。繪制ROC曲線并分析相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：比較涂陰肺結(jié)核病、健康對照、肺炎血清蛋白組，在耐多藥肺結(jié)核病血清中共鑒定和篩選出17個(gè)差異表達(dá)蛋白(包括9個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)和8個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá))。經(jīng)ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白在耐多藥肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高（耐多藥肺結(jié)核病組：311.31±161.73μg/ml、涂陰肺結(jié)核病組：6.17±6.29μg/ml、肺炎組：6.38±7.72μg/ml、健康對照組：53.73±2

21、0.05μg/ml；p<0.0001），表達(dá)趨勢與iTRAQ的結(jié)果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白鑒別耐多藥肺結(jié)核病與肺炎、健康對照、涂陰肺結(jié)核病的準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性和AUC為91.07%、84.6%、94.6%和0.949。經(jīng)MRM分析發(fā)現(xiàn)蛋白FN1和VTN在耐多藥肺結(jié)核病中表達(dá)水平降低，表達(dá)趨勢與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果完全一致，但VTN蛋白的ELISA結(jié)果與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果不一致。
　　結(jié)論：TBA3E蛋白鑒別耐多