極長(zhǎng)鏈脂肪酸與2型糖尿病大鼠腦Aβ生成的關(guān)系研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能減退為主要臨床表現(xiàn)。AD的特征性病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(amyloid protein，Aβ)在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不僅是老年人常見(jiàn)的疾病，也是糖尿病(diabetes mellitus，DM)病人高發(fā)的疾病。這對(duì)糖尿病病人無(wú)疑是雪上添霜。因此，亟待弄清糖尿病病人高發(fā)AD的原因，找到

2、干預(yù)措施。
　　基于以下兩個(gè)事實(shí):(1)報(bào)道顯示，AD病人腦中極長(zhǎng)鏈脂肪酸(verylong chain fatty acids，VLCFA.，≥C22)水平增加。VLCFA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有脂毒性，可以導(dǎo)致細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多，氧化應(yīng)激增強(qiáng)。而氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的Aβ生成增多的重要機(jī)制之一。(2)糖尿病是糖脂代謝紊亂疾病。我們假設(shè)，在糖尿病狀態(tài)下，脂代謝的紊亂會(huì)使腦中的VLC

3、FA聚集，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激，使Aβ異常生成增加，最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙，糖尿病AD發(fā)生。
　　為了證實(shí)此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)用高脂飲食加小劑量STZ的方法誘導(dǎo)2型糖尿病的大鼠模型，觀察2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶情況，以及腦中Aβ的生成、氧化應(yīng)激水平和VLCFA的變化，探討VLCFA在2型糖尿病大鼠腦Aβ生成中的作用，為預(yù)防及治療糖尿病AD提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　以本實(shí)驗(yàn)室侯連國(guó)等人制備的2型糖尿病大鼠

4、的腦組織為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(Con)和2型糖尿病組(DM)。
　　2 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力
　　用上海吉量軟件科技有限公司Morris水迷宮，采用定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，分別記錄大鼠的平均逃避潛伏期、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和第一次到達(dá)原平臺(tái)的時(shí)間，以評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　3 ELISA檢測(cè)腦組織Aβ40、BACE1的含量
　　用日本IBL公司ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，腦A

5、β40的含量以pg/mgprotein表示;腦BACE1的含量以ng/μgprotein表示。
　　4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腦APP和BACE1的mRNA表達(dá)
　　用美國(guó)OMEGA公司總RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。以18S rRNA做內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定APP、BACE1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　5免疫組織化學(xué)分析腦組織APP的蛋白水平
　　對(duì)大鼠腦組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分析APP的蛋

6、白表達(dá)水平。
　　6氣相色譜分析腦組織VLCFA
　　提取各組大鼠腦組織脂肪酸，用日本島津公司氣相色譜儀(GC-2010Plus)分析每種VLCFA的含量。
　　7 TBA法測(cè)定腦組織丙二醛(MDA)含量
　　采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法進(jìn)行測(cè)定，腦MDA的含量以nmol/mgprot表示。
　　8 Western blot檢測(cè)NOX4，p47和HO-1的蛋白表達(dá)
　　提取大鼠腦組織總蛋白，Wes

7、tern blot測(cè)定NOX4，p47和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　9數(shù)據(jù)處理
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用x±SD表示。逃避潛伏期數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其它數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗(yàn)分析兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

8、r>　　1 DM大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降
　　與Con組相比，雖然DM組大鼠第一天的逃避潛伏期有所延長(zhǎng)，但隨后幾天均沒(méi)有明顯差異。DM組大鼠，與Con組相比，穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少，第一次到達(dá)原平臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明，2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　2 DM大鼠腦中Aβ生成增加
　　2.1腦組織Aβ的含量
　　ELISA結(jié)果顯示，Con組和DM組大鼠腦組織Aβ40含量分別為

9、:Con(4.87±0.71 pg/mg protein)，DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM組腦組織Aβ含量較Con組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明，糖尿病大鼠腦Aβ水平增加。
　　2.2腦組織APP的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，DM組腦組織APP mRNA的表達(dá)水平(0.046±0.014)較Con組(0.025±0.007)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

10、
　　免疫組化結(jié)果顯示，DM組腦組織中APP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、著色深度較Con組明顯增加;圖像分析顯示，DM組大鼠腦中APP陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值較Con組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　表明，糖尿病大鼠腦APP的mRNA和蛋白表達(dá)均增加。
　　2.3腦組織BACE1的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，DM組腦組織BACE1 mRNA的表達(dá)水平(0.912±0.038)較Con組(0.661±0.

11、118)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　ELISA結(jié)果顯示，DM組腦組織BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μgprotein)較Con組(0.78±0.06 ng/μg protein)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　表明，糖尿病大鼠腦BACE1的mRNA和蛋白表達(dá)均增加。
　　以上結(jié)果表明，糖尿病大鼠腦中APP的β-分泌酶裂解途徑上調(diào)，從而導(dǎo)致Aβ生成增加，出現(xiàn)類(lèi)似AD

12、的病理改變。
　　3 DM大鼠腦中C26∶0水平增加
　　氣相色譜結(jié)果顯示，DM組C26∶0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)較Con組(18.38±6.29μmol/g tissue)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); C22∶0、C24∶0含量在DM組與Con組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明，糖尿病大鼠腦極長(zhǎng)鏈脂肪酸C26∶0水平增加。
　　4 DM大鼠腦中C26∶0水

13、平與Aβ含量呈正相關(guān)
　　相關(guān)分析結(jié)果顯示，腦組織C26∶0水平與Aβ含量呈正相關(guān)(r=0.557，P=0.016)。表明，糖尿病大鼠腦C26∶0水平增加與Aβ生成增加有關(guān)。5 DM大鼠腦氧化應(yīng)激增強(qiáng)
　　TBA結(jié)果顯示，DM組腦組織MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mgprotein)較Con組(1.83±0.19 nmol/mg protein)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　Weste

14、rn blot結(jié)果顯示，DM組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)NOX4，p47和HO-1的蛋白表達(dá)水平均高于Con組。
　　表明，糖尿病大鼠腦氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。
　　6 DM大鼠腦中C26∶0水平與MDA含量呈正相關(guān)
　　相關(guān)分析結(jié)果顯示，腦組織C26∶0水平與MDA含量呈正相關(guān)(r=0.504，P=0.033)。表明，糖尿病大鼠腦C26∶0水平增加與氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　12型糖尿病大鼠的認(rèn)知功能