B-ALL細胞影響骨髓間充質(zhì)干細胞分化的實驗研究.pdf

1、第一部分:Notch信號通路相關配體Jagged1在兒童急性白血病中的表達特點及意義
　　目的：探討Notch信號通路相關配體Jagged1在急性白血病中的表達特點及臨床意義。
　　方法：收集88例初診兒童急性白血病骨髓液（包括AML25例，B-ALL52例，T-ALL11例），18例ITP患兒骨髓液為對照組。應用Real-Time PCR法檢測各組骨髓單個核細胞中Jagged1 mRNA表達水平。
　　結果：

2、　　1)Jagged1在AML組、B-ALL組、T-ALL組及對照組均有表達；
　　2)AML組Jagged1表達水平高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05，n=25）；
　　3）B-ALL組Jagged1表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，n=52）；
　　4）T-ALL組Jagged1表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，n=11）；
　　5）在B-ALL組中，高危組Jagg

3、ed1表達水平高于在標危組與中危組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　　結論：Notch相關配體Jagged1在不同類型兒童急性白血病中的表達水平不一致，與對照組相比，B-ALL中呈高表達，T-ALL呈低表達，AML中呈正常表達，提示在ALL中存在Jagged1的表達異常。
　　第二部分:B-ALL細胞影響骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化及其機制研究
　　目的：研究B-ALL細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marr

4、ow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化的影響，并探討Notch信號通路在此過程中的作用。
　　方法：采用B-ALL細胞與BMSCs體外共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)微環(huán)境，以BMSCs單獨培養(yǎng)及正常骨髓單個核細胞與BMSCs共培養(yǎng)作為對照。成骨誘導條件下共培養(yǎng)3天后，Real time PCR及Western-blot方法檢測各組成骨分化標志物OPN、OCN、Runx2 mRNA和蛋白表達差異；成骨誘導條件下

5、共培養(yǎng)14天后，茜素紅S染色檢測BMSCs的礦化能力，堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）試劑盒檢測ALP活性。最后通過重組蛋白Jagged1與中和抗體anti-Jagged1-Ab激活與抑制BMSCs中Notch信號通路，探討B(tài)-ALL細胞是否通過Jagged1激活BMSCs中Notch信號通路影響B(tài)MSCs向成骨細胞分化。
　　結果：
　　1）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)組中，成骨分化標志O

6、PN、OCN表達水平較對照組降低，同時ALP活性及礦化能力較對照組減低；
　　2）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)后，BMSCs中Notch信號通路下游基因Hes1表達水平較對照組上調(diào)，提示BMSCs中的Notch細胞通路被激活；
　　3）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中加入anti-Jagged1-Ab中和抗體后，Notch信號通路被抑制，同時成骨分化標志OPN、OCN表達上調(diào)；
　　4）BMSCs中加入重組蛋

7、白Jagged1能夠激活Notch信號通路，同時成骨分化標志OPN、OCN表達下降；
　　5）BMSCs中Notch信號通路被抑制后，其下游基因Hes1表達下調(diào)，而成骨分化特異轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達上調(diào)；
　　結論：B-ALL細胞可抑制BMSCs向成骨細胞分化，其可能的機制是B-ALL細胞通過Jagged1激活BMSCs中的Notch信號通路，其下游基因Hes1活化降低成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達水平，從而抑制BM

8、SCs向成骨細胞分化。
　　第三部分:B-ALL細胞影響骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化及其機制研究
　　目的：研究B-ALL對骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）內(nèi)皮分化的影響，并探討在此過程中可能存在的機制。
　　方法：采用B-ALL細胞與BMSCs體外共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)微環(huán)境，以BMSCs單獨培養(yǎng)及正常骨髓單個核細胞與BMSCs共培養(yǎng)作為對照。共培養(yǎng)三

9、天與七天后，Real time PCR檢測各組內(nèi)皮分化標志物Flk-1、CD31、vWF mRNA表達差異；Western-blot方法檢測各組內(nèi)皮分化特異標志CD31、Flk-1蛋白表達差異；再通過共培養(yǎng)中加入中和抗體anti-Jagged1-Ab抑制BMSCs中Notch信號通路，驗證B-ALL細胞是否通過Jagged1激活BMSCs中Notch信號通路影響B(tài)MSCs向內(nèi)皮細胞分化。最后采用ELISA檢測各組培養(yǎng)上清中VEGF分泌蛋

10、白表達水平，探討B(tài)-ALL細胞影響B(tài)MSCs向內(nèi)皮分化的機制。
　　結果：
　　1）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)三天后，BMSCs內(nèi)皮分化標志Flk-1、CD31、vWF mRNA表達水平及Flk-1、CD31蛋白表達水平較對照組升高，但無顯著差異(P>0.05)；
　　2）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)七天后，BMSCs內(nèi)皮分化標志Flk-1、CD31、vWF mRNA表達水平及Flk-1、CD31蛋白表達水平

11、較對照組升高，有顯著差異（P<0.05）；
　　3）B-ALL細胞與BMSCs共培養(yǎng)后，Notch信號通路被激活；
　　4）共培養(yǎng)組中加入anti-Jagged1-Ab中和抗體后，Notch信號通路被抑制，但Flk-1、CD31、vWF mRNA表達水平及Flk-1、CD31蛋白表達水平無明顯改變；
　　5）采用ELISA檢測共培養(yǎng)組中VEGF分泌蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組中VEGF表達水平上調(diào)，同時B-ALL細胞與B