PCBP1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞維持中的作用研究.pdf

1、目的:研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Skin squamous-cell carcinoma, SCC）干細(xì)胞維持過程中多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白PCBP1的表達，并在體外和體內(nèi)驗證其對SCC發(fā)生發(fā)展的作用，進一步研究調(diào)控PCBP1在SCC干細(xì)胞維持過程中表達抑制的內(nèi)在分子機制。
　　方法:1、采取無血清成球培養(yǎng)法從SCC細(xì)胞系COLO-16富集腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)，使之繼續(xù)增殖、去分化、建立較為穩(wěn)定的CSC細(xì)

2、胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光技術(shù)驗證細(xì)胞內(nèi)腫瘤自我更新標(biāo)志物和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達情況，判斷CSC建系是否成功。
　　2、將上述CSC細(xì)胞正常連續(xù)培養(yǎng)3天，分別收取每天CSC細(xì)胞的RNA和總蛋白，利用定量PCR和免疫印跡實驗檢測CSC干性維持過程中PCBP1的表達變化。
　　3、構(gòu)建PCBP1過表達的CSC細(xì)胞系和對照細(xì)胞系，通過軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠成瘤實驗闡述PCBP1在SCC發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　4、利用生物

3、信息學(xué)工具Targetscan發(fā)現(xiàn)PCBP1基因3'-UTR區(qū)域含有較為保守的微小RNA-490-3p(miR-490-3p)種子序列，利用定量PCR驗證miR-490-3p在CSC干性維持過程中的表達情況。
　　5、富集多核糖體結(jié)合的mRNA，檢測翻譯依賴性的PCBP1 mRNA表達，確認(rèn)PCBP1在CSC干性維持中表達下降的調(diào)控層面。
　　6、構(gòu)建包含PCBP1基因3'-UTR區(qū)域的螢光素酶報告基因質(zhì)粒及對應(yīng)的突變質(zhì)粒，

4、驗證miR-490-3p表達改變對PCBP1的直接調(diào)控。7、進一步在20例臨床SCC組織樣本中檢測miR-490-3p和PCBP1的表達，分析二者表達的相關(guān)性。
　　結(jié)果:1.我們從COLO-16細(xì)胞系中成功富集、擴增得到CD34陽性的CSC細(xì)胞，干細(xì)胞標(biāo)志物如CD44、SSEA4、TR1-60、和TR1-81都呈陽性表達。
　　2、發(fā)現(xiàn)在CSC干性維持過程中，PCBP1基因mRNA水平表達較為穩(wěn)定，但隨CSC細(xì)胞培養(yǎng)時間延

5、長，PCBP1蛋白表達顯著下降。
　　3、在上述獲得的CD34+CD44+CSC細(xì)胞中過表達PCBP1，可顯著抑制其在體外的增殖能力和裸鼠體內(nèi)成瘤能力。
　　4、發(fā)現(xiàn)miR-490-3p可靶向PCBP1基因3'-UTR，在CSC干性維持過程中miR-490-3p表達呈逐漸增加趨勢。
　　5、多核糖體結(jié)合的mRNA中，PCBP1在CSC干性維持后期表達下降，證實其蛋白表達下降的機制是轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平調(diào)控。
　　6、

6、PCBP13'-UTR體外熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-409-3p的表達高低可直接影響螢光素酶活性，即PCBP1是miR-490-3p的真實靶點。
　　7、SCC組織樣本中也發(fā)現(xiàn)miR-490-3p表達異常增加、PCBP1表達下降，二者表達呈負(fù)性相關(guān)。
　　結(jié)論:PCBP1在SCC干細(xì)胞維持過程中蛋白表達下降，可抑制SCC體外增殖和體內(nèi)成瘤能力，其表達受到上游miR-490-3p的負(fù)向調(diào)控，二者在SCC組織中表達呈負(fù)相關(guān)