重組核糖核酸酶A的表達和復性研究.pdf

1、核糖核酸酶A(Ribonuclease A，EC3.1.27.5，RNaseA)在DNA的制備、抑制病毒復制及作為基礎研究中的模型蛋白等方面具有廣泛的用途和需求，但商品化的RNaseA都是從動物的胰臟中分離提純得到，這不僅限制了其大量獲取，而且造成流程復雜，生產(chǎn)成本高。因此利用基因工程手段大量獲取具有生物活性的RNase A已成為研究的熱點。目前文獻報道中RNase A的表達多通過可溶的形式表達，表達量少，這限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應用。<

2、br>　　 基于此，本研究利用PCR技術從牛胰臟的基因組中擴增出RNase A的編碼序列，將其插入到帶組氨酸標簽的高效表達質(zhì)粒pET28a中，然后利用E.coliBL21(DE3)以包含體的形式高效表達，之后利用稀釋法和金屬螯合色譜法(IMAC)對包含體進行了復性，為其工業(yè)化應用提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　 研究結果表明，利用PCR技術從牛胰臟的基因組中擴增出RNase A編碼基因，測序結果表明其與組織DNA的同源性為100

3、％；將此目標基因插入到載體pET28a中后，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)宿主菌中，得到pET28a-RNaseA基因工程表達菌；RNase A基因的插入沒有影響基因工程菌的生長規(guī)律，經(jīng)過誘導，發(fā)現(xiàn)目標蛋白主要以包含體的形式表達；目標蛋白最優(yōu)的表達條件為：培養(yǎng)菌的OD600為0.4時(約需培養(yǎng)2 h，此時菌體處于對數(shù)生長前期)開始誘導表達，IPTG濃度為1 mM，誘導3 h，此條件下RNase A包含體的表達量為60 mg/L培養(yǎng)液

4、；包含體經(jīng)過脲、表面活性劑和PE緩沖液的洗滌，最終目標蛋白的純度達到83％。
　　 RNase A包含體存在最佳的變性時間(1 h)；稀釋復性僅可以使低濃度的蛋白(≤0.1 mg/mL)獲得較好的復性效果(復性24 h，活性收率為52％)；IMAC法可使蛋白質(zhì)終濃度為0.5 mg/mL的RNaseA復性24 h后達到80％的活性收率，同時實現(xiàn)了RNaseA包含體的純化(復性產(chǎn)物的純度為97％)。與稀釋復性相比，在相同的蛋白終濃度