Akt1磷酸化核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1及其功能研究.pdf

1、Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，能夠通過(guò)磷酸化激活或抑制其下游一系列底物如GSK-3、Bad、easpase9、NF-Rb和p27kipl等參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝的調(diào)節(jié)。Akt在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中也起著重要作用，它的持續(xù)活化能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。因此深入研究Akt調(diào)節(jié)機(jī)體正常的生理狀態(tài)和參與疾病發(fā)生的分子機(jī)制也成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。
　　 核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1（s

2、pecial AT-rich sequences binding protein 1，SATBI）能夠自身多聚化，圍繞異染色質(zhì)形成籠狀結(jié)構(gòu)分布在細(xì)胞核中，SATBI不僅結(jié)合染色質(zhì)DNA的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(matrix attachment regions，MARs)，也結(jié)合核基質(zhì)(nuclear matrix)，能夠使DNA錨定在核基質(zhì)并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)。SATBl的磷酸化、乙酰化和小泛素化樣修飾(sumoylation)可調(diào)節(jié)其D

3、NA結(jié)合能力和細(xì)胞核內(nèi)亞結(jié)構(gòu)的定位；SATB1與多種蛋白質(zhì)相互作用，能夠募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物和組蛋白修飾酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)其靶基因表達(dá)的時(shí)空特異性調(diào)控。SATBI在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移和X染色體失活等方面起著重要作用。
　　 已有研究證實(shí)SATB1能被PKC磷酸化，SATB1的這種磷酸化狀態(tài)與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力相關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有的研究和Scansite的數(shù)據(jù)我們推測(cè)SATB1能夠被Akt磷酸化。由數(shù)據(jù)顯示SATB1含有2個(gè)候選

4、磷酸化位點(diǎn)，分別是S47(RGRLGST)和S557(IRRFLSL)。首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/SATBlwt，利用免疫沉淀方法及免疫印跡法驗(yàn)證蛋白激酶Aktl與野生型SATB1分子間的激酶底物關(guān)系；接下來(lái)將SATB1分子的47位點(diǎn)的絲氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得Pgex4t-1/SATB1$47A、Pgex4t-1/SATBlS47D，應(yīng)用體外激酶活性分析方法確定SATB1分子被Aktl磷酸化的位點(diǎn)。同時(shí)還設(shè)計(jì)了免疫共沉淀方法和GST

5、-pulldown實(shí)驗(yàn)鑒定Aktl與SATBI分子間是否存在相互作用。最后我們構(gòu)建了Pgfp-N2/SATBI，去探索SATB1在被Aktl磷酸化之后對(duì)于其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況、穩(wěn)定性的影響。
　　 根據(jù)研究，我們得出了以下結(jié)論。第一，Aktl特異性磷酸化SATBI的第47位點(diǎn)的絲氨酸；第二，Aktl與SATB1之問(wèn)沒(méi)有相互作用；第三，SATBI被Aktl磷酸化后影響了自身的穩(wěn)定性。深入研究Aktl調(diào)節(jié)機(jī)體正常的生理狀態(tài)和參與疾病