腺病毒轉(zhuǎn)染siMDM2和NDRG2基因療法對(duì)SCC-13的增殖和凋亡的影響和機(jī)制.pdf

1、皮膚癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要包括鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和基底細(xì)胞癌。SCC在組織病理學(xué)上表現(xiàn)為侵襲性生長(zhǎng)，自表皮向下突破基底層侵入真皮，呈條索狀和不規(guī)則團(tuán)塊狀，由正常鱗狀細(xì)胞和非典型鱗狀細(xì)胞組成。前者分化好，可形成角質(zhì)形成細(xì)胞，后者分化不好，即所謂癌細(xì)胞。
　　SCC的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療。然而經(jīng)過(guò)上述治療的患者在2年內(nèi)仍然可能復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鑒于在腫瘤治療過(guò)程中基因療法的快速進(jìn)展和單一基因治療的低穩(wěn)定性和

2、有效性，以及先前研究所表明的攜帶有兩個(gè)或者兩個(gè)以上基因的重組腺病毒對(duì)多發(fā)性骨髓瘤以及喉癌等多個(gè)腫瘤具有細(xì)胞毒性，因而需要一個(gè)具有高的穩(wěn)定性和有效性的聯(lián)合基因治療方法來(lái)進(jìn)一步改善SCC患者的預(yù)后。在本課題中重點(diǎn)研究了與人類重組野生型p53基因相關(guān)的N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(NDRG2)以及鼠雙倍突變體2(MDM2)的單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SCC的作用。
　　p53是一個(gè)著名的抑癌基因，p53信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生中最常見(jiàn)的突變通路。當(dāng)發(fā)生D

3、NA損傷和各種細(xì)胞毒性時(shí)，p53就會(huì)誘導(dǎo)受損細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。p53不僅在腫瘤抑制中起著重要作用，它還是一個(gè)廣泛的轉(zhuǎn)錄因子。它調(diào)節(jié)著2500多種基因，其中絕大部分的基因都與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲有關(guān)。治療被引進(jìn)，作為其引起凋亡的結(jié)果，在數(shù)個(gè)臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的致死性作用，這為控制腫瘤打開(kāi)了一道新的大門NDRG2為p53基因的靶基因，且可不依賴p53基因單獨(dú)起作用。
　　NDRG2屬于NDRG家族的一員。它

4、與ABH超家族具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性。它含有兩個(gè)亞型。主要的氨基酸序列信息表明:這兩種NDRG2蛋白都顯示了與ABH超家族顯著地結(jié)構(gòu)相似性。NDRG2通過(guò)調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞因子在細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等許多生物過(guò)程中扮演抗增殖、抗侵襲、促凋亡等多重角色。在多種腫瘤細(xì)胞中NDRG2的表達(dá)減少或缺失。另外，多種惡性腫瘤的預(yù)后與腫瘤表達(dá)NDRG2呈負(fù)相關(guān)。近些年來(lái)，許多體內(nèi)和體外研究表明NDRG2在很多腫瘤細(xì)胞中引起細(xì)胞凋亡，具有抗增殖

5、和防擴(kuò)散作用。NDRG2是P53的一個(gè)新的靶基因，參與了細(xì)胞中的DNA損傷反應(yīng)，并且在P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)又是一個(gè)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的新基因。在本次研究中，在體外SCC-13細(xì)胞系以及SCC裸鼠模型中，探索了攜帶siMDM2和NDRG2基因的重組腺病毒對(duì)腫瘤體積退化的影響。
　　鼠雙倍突變體2(MDM2)是一個(gè)原癌基因，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其突變與擴(kuò)增，mdm2擴(kuò)增與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。mdm2基因最初是

6、從一個(gè)含有雙微體(murine double minute，MDM)的自發(fā)轉(zhuǎn)化的BALB/3T3DM細(xì)胞中克隆出來(lái)的一個(gè)高度擴(kuò)增的基因，此基因位于小鼠的第10號(hào)染色體的CⅠ-C3區(qū)，1992年Momand等人首次分離和證明了大鼠的mdm2基因產(chǎn)物是一種分子為90000Da的蛋白質(zhì)。野生型p53誘導(dǎo)MDM2的表達(dá)，反過(guò)來(lái)，MDM2通過(guò)促進(jìn)野生型p53的降解以及抑制其轉(zhuǎn)錄活性來(lái)形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)。MDM2通過(guò)負(fù)調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄活性，介導(dǎo)細(xì)胞阻

7、滯和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤形成，從而參與了許多人類癌癥的發(fā)生。MDM2的超表達(dá)對(duì)抗p53基因療法對(duì)腫瘤的治療。從而，對(duì)p53-MDM2反饋回路進(jìn)行干擾，就為恢復(fù)p53腫瘤抑制活性，提供了一條新的抗腫瘤策略。MDM2是一種E3泛素連接酶，也是p53通路的重要調(diào)節(jié)者。它以兩種方式負(fù)調(diào)節(jié)p53:一種是通過(guò)直接結(jié)合來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄;另一種是通過(guò)它的E3連接酶活性來(lái)降解p53蛋白。ARF直接結(jié)合MDM2然后抑制E3泛素酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤細(xì)

8、胞中，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療來(lái)提高野生型p53表達(dá)的增加，是一種可能的克服p53基因突變的治療方法。Lang等在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):瘤內(nèi)注射含p53的腺病毒載體都導(dǎo)致了p53基因的轉(zhuǎn)錄和功能性外源性p53的表達(dá)。因此，通過(guò)特定小干擾RNA(siRNA)技術(shù)直接下調(diào)MDM2表達(dá)對(duì)治療具有P53基因表達(dá)的皮膚癌或許是一個(gè)有效的方法。
　　目的:研究不同重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2

9、-NDRG2基因療法對(duì)SCC細(xì)胞系及荷瘤小鼠模型的治療作用，以期為臨床找到更有效的治療SCC的方法。
　　方法:(1)委托漢恒生物科技構(gòu)建重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2，利用293A細(xì)胞進(jìn)行病毒繁殖、純化，得到足夠劑量和濃度的基因治療試驗(yàn)用病毒。
　　(2)對(duì)購(gòu)買的SCC-13細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇、增殖、傳代等體外培養(yǎng)，并進(jìn)行重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、

10、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　(3)建立荷瘤小鼠模型，皮下注射0.9％NaCl、重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2治療，觀察各組小鼠腫瘤體積大小。
　　(4)利用CCK-8試劑盒檢測(cè)重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染SCC-13細(xì)胞系后SCC-13細(xì)胞的增殖潛力。
　

11、　(5)利用RT-PCR和Western blot從基因和蛋白質(zhì)水平分別研究MDM2、NDRG2基因在重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染的SCC-13細(xì)胞系內(nèi)的mRNA表達(dá)變化以及相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的變化，尤其是從SCC-13細(xì)胞caspase3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步研究重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治療引起SCC-13

12、細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　(6)AnnexinⅤ/PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析評(píng)估荷瘤小鼠SCC-13細(xì)胞凋亡率。
　　(7)利用MTT研究重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染SCC-13細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)SCC-13細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)獲得了足夠劑量和濃度的試驗(yàn)用SCC-13細(xì)胞及重組腺病毒。
　　(2)SCC-13細(xì)胞能夠被重組腺病

13、毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2高度有效轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后48h檢測(cè)到GFP的表達(dá)。且在MOI為100時(shí)感染效率最好。
　　(3)皮下注射重組腺病毒0.9％NaCl、Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2各組小鼠腫瘤體積比較顯示:0.9％NaCl和Ad-GFP組平均腫瘤體積最大，Ad-siMDM2、Ad-NDRG2組平均腫瘤體積相近，Ad-

14、siMDM2-NDRG2組平均腫瘤體積最小。
　　(4)在Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染的SCC-13細(xì)胞內(nèi)，與Ad-GFP組才目比，Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2組對(duì)SCC-13細(xì)胞增殖具有明顯的抑制。
　　(5)在基因水平的RT-PCR研究結(jié)果顯示:①與對(duì)照組相比，重組腺病毒Ad-siMDM2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染

15、的SCC-13細(xì)胞內(nèi)MDM2基因的mRNA表達(dá)顯著減少;②SCC-13細(xì)胞內(nèi)本身NDRG2基因表達(dá)水平較低，但在重組腺病毒Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染的SCC-13細(xì)胞內(nèi)，NDRG2的超表達(dá)相應(yīng)增加了其mRNA的表達(dá)。重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治療可促進(jìn)SCC-13caspase3蛋白表達(dá)。在蛋白質(zhì)水平的Western blot研究結(jié)果，驗(yàn)證了

16、上述基因研究結(jié)果。
　　(6)對(duì)荷瘤小鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行的AnnexinⅤ/PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果顯示:MDM2基因沉默和NDRG2基因超表達(dá)顯著引起小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　(7)MTT研究SCC-13細(xì)胞毒性效應(yīng)結(jié)果顯示:Ad-siMDM2-NDRG2組與Ad-GFP組相比較，P＜0.05;同樣Ad-siMDM2-NDRG2組與Ad-siMDM2組和Ad-NDRG2組相比較P＜0.05。
　　結(jié)論:重組腺病