崗梅三萜皂苷生物合成相關(guān)CYPs基因的挖掘與功能研究.pdf

1、目的:
　　三萜皂苷為崗梅的主要藥效活性成分，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分離困難等問題限制了這類成分的獲取，因此研究其生物合成具有重要意義。本研究的目的是從崗梅(Ilexasprella(Hook.f.et Arn.) Champ.ex Benth）轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘可能與崗梅三萜皂苷生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因——細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYPs)基因，并對(duì)發(fā)掘出的候選基因進(jìn)行功能鑒定，闡明崗梅三萜皂苷生物合成下游途徑的氧化修飾機(jī)制，為探索三萜皂苷的

2、人工生物合成奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.CYPs基因的篩選本研究利用12個(gè)已鑒定的三萜合成相關(guān)CYPs的氨基酸序列作為參考對(duì)象，對(duì)崗梅根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)做BLASTp，篩選同源性大于40％的候選基因;將候選CYPs和已鑒定的CYPs的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)合KEGG代謝通路進(jìn)一步篩選可能的CYPs基因。
　　2.基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建用試劑盒方法提取崗梅根總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA后，通過PCR的方法獲得目的基因。

3、用Gateway克隆、傳統(tǒng)的酶連接克隆或In-Fusion克隆的方法構(gòu)建目的基因的表達(dá)質(zhì)粒。
　　3.蛋白功能驗(yàn)證研究將目的基因的表達(dá)載體用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)染至能特異性表達(dá)擬南芥細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的釀酒酵母菌株S.cerevisiae WAT11中，用2％半乳糖誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，通過Western Blot驗(yàn)證蛋白的表達(dá)情況。取Western Blot驗(yàn)證過的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子WAT11/pEXP410（候選CYP表達(dá)菌株）、W

4、AT11/pEXP3079+pESC-TRP-410（AS與候選CYP共表達(dá)菌株）及其他對(duì)照菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，用MS方法檢測(cè)它們的代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)果:
　　1.CYPs候選基因綜合BLASTp、系統(tǒng)發(fā)生分析及KEGG代謝通路分析，篩選出4個(gè)可能參與崗梅三萜皂苷生物合成的CYPs基因:CL410.Contig1可能編碼α-/β-香樹脂醇-24-羥化酶;CL3010.Contig1和CL3010.Contig2可能編碼具有催

5、化α-香樹脂醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇骨架C-28位氧化的氧化酶;CL3008.Contig1可能編碼具有催化α-/β-香樹脂醇C-12，13位環(huán)氧化的氧化酶，為接下來的基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。
　　2.候選基因CL410-1和CL3010-1的克隆和質(zhì)粒構(gòu)建選取兩個(gè)篩選出的CYPs候選基因CL410.Contig1和CL3010.Contig1（分別命名為CL410-1、CL3010-1）進(jìn)行克隆，成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pGEM-T

6、Easy410以及酵母表達(dá)質(zhì)粒pEXP410、pESC-TRP-410、pESC-TRP-3010。成功獲得了CL410-1的全長(zhǎng)編碼區(qū)，共1545 bp，編碼一個(gè)514 aa的蛋白，CL3010-1的全長(zhǎng)編碼區(qū)共1440 bp，編碼一個(gè)476 aa的蛋白。
　　3.CL410-1蛋白功能Wersten Blot結(jié)果顯示，在半乳糖誘導(dǎo)下，重組酵母WAT11/pEXP410能夠產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的CL410-1蛋白，蛋白表達(dá)量由0時(shí)

7、刻開始逐漸增多，在4h時(shí)左右達(dá)到頂峰后逐漸降低;WAT11/pEXP3079+pESC-TRP-410能夠產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的IaAS3079和CL410-1蛋白，但CL410-1的表達(dá)量偏低。
　　MS分析結(jié)果顯示，重組酵母菌WAT11/pEXP3079+pESC-TRP-410的培養(yǎng)液及菌體未能檢測(cè)到預(yù)期產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜特征離子碎片m/z422、m/z409。
　　結(jié)論:
　　本研究共篩選出4個(gè)可能參與崗梅三萜皂苷生