擬南芥DOI2基因調(diào)節(jié)鐵營(yíng)養(yǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制.pdf

1、鐵元素是生物有機(jī)體必須的微量元素，鐵缺乏會(huì)導(dǎo)致生物有機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，同時(shí)，鐵在細(xì)胞內(nèi)含量過高又會(huì)造成對(duì)有機(jī)體的氧化毒害。地球中鐵的含量十分豐富，但是由于鐵的化學(xué)特點(diǎn)，在正常條件下趨向于形成三價(jià)態(tài)鐵Fe(Ⅲ)的形式，不利于植物吸收，因此全球范圍內(nèi)普遍存在植物鐵缺乏的狀況，并進(jìn)一步造成食物鏈上級(jí)的動(dòng)物及人類鐵營(yíng)養(yǎng)缺乏。植物已經(jīng)適應(yīng)了缺鐵的環(huán)境條件，并在缺鐵條件下啟動(dòng)高效吸收鐵的機(jī)制。在高等的被子植物中，當(dāng)環(huán)境鐵缺乏時(shí)，非本科植物

2、主要通過以還原根際Fe(Ⅲ)的策略從土壤中高效獲得鐵，被稱為機(jī)理Ⅰ；而禾本科植物主要通過分泌酸性有機(jī)小分子，將土壤中的Fe(Ⅲ)螯合并活化，并吸收入體內(nèi)，被稱為機(jī)理Ⅱ。研究表明，機(jī)理Ⅰ和機(jī)理Ⅱ所涉及的諸多功能基因在非禾本科和禾本科植物中均存在，并且功能和蛋白同源性均比較保守，說明機(jī)理Ⅰ和機(jī)理Ⅱ在植物中并非截然區(qū)分的。
　　 由于高效鐵吸收的諸多金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并非嚴(yán)格特異的，因此在植物啟動(dòng)對(duì)缺鐵的響應(yīng)時(shí)，同時(shí)需要維持體內(nèi)諸多金屬

3、離子的穩(wěn)態(tài)，以保證不因缺鐵反應(yīng)而造成體內(nèi)金屬離子過量的傷害。植物體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)的維護(hù)仍然需要復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制，同時(shí)涉及諸多非特異性的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，通過將包括鐵在內(nèi)的過量的金屬離子分配到細(xì)胞壁、液泡等不容易造成傷害的區(qū)域，區(qū)隔化這些過量的金屬離子同時(shí)起到儲(chǔ)存的作用。
　　 最初，我們的研究興趣集中在植物對(duì)干旱反應(yīng)的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。為此已經(jīng)成功利用對(duì)溫度敏感的遠(yuǎn)紅外熱成像系統(tǒng)，以葉片表面溫度微小變化為監(jiān)控指標(biāo)，構(gòu)建了有效

4、的遺傳學(xué)篩選體系，從而使我們可以鑒定多種與干旱有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變體。激活標(biāo)簽(activation tagging)技術(shù)是以功能獲得(gain-of function)突變體為研究對(duì)象，克服功能缺失(loss-of function)突變體由于功能冗余基因存在的限制，在植物功能基因組學(xué)的研究中具有重要的作用。
　　 我們從雌二醇誘導(dǎo)T-DNA突變體庫(IGDB-XVET-DNA collections)中篩選得到其中一個(gè)干旱反

5、應(yīng)的突變體(Doi2)。在干旱條件下，Doi2失水較快。但是更令人感興趣的是，該突變體在雌二醇誘導(dǎo)下同時(shí)缺鐵處理，表現(xiàn)為葉片失綠，表現(xiàn)出明顯的缺Fe癥狀。通過TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)技術(shù)獲得T-DNA插入的基因組旁鄰序列，克隆了突變體的基因，它編碼一個(gè)類似受體的蛋白激酶(Receptor-Like Kinase，RLK)。
　　 通過生物信息學(xué)分析，DOI2編碼一個(gè)2

6、99氨基酸的蛋白，該蛋白富含半胱氨酸殘基，具有N段的信號(hào)肽和C端的單一跨膜域結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在其肽鏈中包含兩個(gè)DUF26(domain of unknown function No.26)結(jié)構(gòu)域，DUF26的功能目前為止還沒有更明確的闡述。
　　 構(gòu)建DOI2超表達(dá)突變體SP：DOI2及鑒定DOI2功能缺失純合突變體doi2，我們對(duì)DOI2超表達(dá)植株、功能缺失植株及野生型植株進(jìn)行了深入地分析，同時(shí)與已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行比較，確認(rèn)了DOI

7、2超表達(dá)在擬南芥Col0生態(tài)型中的表型，及DOI2超表達(dá)導(dǎo)致植株對(duì)缺鐵環(huán)境敏感，而產(chǎn)生缺鐵黃化的表型，該表型只與Fe缺乏有關(guān)，排除了其他因素的影響。同時(shí)，通過GUS組織表達(dá)分析及GFP熒光定位分析，發(fā)現(xiàn)DOI2的組織表達(dá)及細(xì)胞定位與其表型是相對(duì)應(yīng)的，即DOI2在擬南芥幼苗根部的成熟區(qū)表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)，可以通過其單一的跨膜區(qū)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。
　　 由于眾所周知的根際環(huán)境pH值對(duì)根際可利用Fe的濃度的影響，以及擬南芥作為機(jī)理Ⅰ植

8、物在缺鐵反應(yīng)中啟動(dòng)質(zhì)膜H+-ATPase酸化根際環(huán)境的功能，我們對(duì)DOI2與擬南芥質(zhì)膜H+-ATPase-AtAHAs的關(guān)系進(jìn)行了研究。首先，DOI2超表達(dá)導(dǎo)致的植株對(duì)根際缺鐵的敏感性與根際pH有關(guān)，其次，DOI2超表達(dá)植株表現(xiàn)出在缺鐵培養(yǎng)基中對(duì)根際酸化的能力有所減弱，這些間接證據(jù)暗示DOI2可影響到擬南芥缺鐵反應(yīng)中啟動(dòng)質(zhì)膜H+-ATPase酸化根際的功能。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，DOI2與擬南芥11個(gè)AtAHAs中的AtAHA3、AtAHA

9、5、AtAHA6、AtAHA7、AtAHA9在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)出互作關(guān)系，其中與AHA7較強(qiáng)的互作關(guān)系尤為令我們感興趣，因?yàn)锳HA7已被證明在擬南芥缺鐵反應(yīng)中起著比較重要的作用。在與DOI2與AHA7互作的進(jìn)一步研究中，我們發(fā)現(xiàn)DOI2與AHA7主要的互作區(qū)域在其肽鏈N側(cè)的第一個(gè)DUF26結(jié)構(gòu)域，這一信息為闡述DUF26結(jié)構(gòu)域的功能提供了新的信息。
　　 通過實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)，我們對(duì)擬南芥缺鐵反應(yīng)有關(guān)的基因AtIRT1

10、、AtFRO2、AtAHA7、AtFIT1以及涉及缺鐵反應(yīng)中被誘導(dǎo)的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡的非特異性金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MTPc3的基因在DOI2超表達(dá)情況下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，DOI2超表達(dá)導(dǎo)致擬南芥野生型植株中可被強(qiáng)烈誘導(dǎo)的相關(guān)基因AtIRT1、AtFRO2的激活受到抑制，存在同樣現(xiàn)象的還有AtAHA7、AtFIT1基因，這一結(jié)果強(qiáng)烈暗示DOI2對(duì)于擬南芥缺鐵反應(yīng)調(diào)控的機(jī)理在于參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上游環(huán)節(jié)的負(fù)調(diào)控。這一結(jié)果受到我們

11、另外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，即在DOI2超表達(dá)植株中，缺鐵處理?xiàng)l件下根際還原力下降。
　　 將DOI2蛋白膜外區(qū)在大腸桿菌中原核表達(dá)并進(jìn)行親和層析純化，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的蛋白可表現(xiàn)出單體、二聚體以及多聚體等相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，同時(shí)這些狀態(tài)之間的比例與環(huán)境的氧化還原狀態(tài)有關(guān)，在較高水平的還原狀態(tài)下才表現(xiàn)為單體和二聚體占優(yōu)勢(shì)的形式，更令人感興趣的是，在不同濃度的過渡金屬離子處理下，DOI2蛋白的不同聚合狀態(tài)表現(xiàn)出與鐵離子濃