煙酸受體GPR109A信號轉導和內吞分子機制研究.pdf

1、煙酸作為一種降脂藥物已經(jīng)在臨床上廣泛使用了50多年，煙酸不僅能夠有效降低LDL-C的同時，還能提高HDL-C的水平，而煙酸受體GPR109A的發(fā)現(xiàn)為治療高血脂和心血管系統(tǒng)疾病提供了一個很好的分子靶標，GPR109A受體信號轉導機制的研究和小分子激動劑藥物的研發(fā)因而受到廣泛的重視。然而GPR109A受體內吞和其介導的信號轉導的詳細機制還不清楚。
　　 研究表明GPR109A受體的內吞主要由GRK2和arrestin3調節(jié)，而Gβγ

2、起到了招募GRK2到細胞膜上的作用。蔗糖預處理或siRNA干擾網(wǎng)格蛋白的表達，GPR109A受體的內吞均受到顯著抑制，說明其內吞是網(wǎng)格蛋白小泡依賴性的。進一步研究表明，當配體去除后，GPR109A能迅速回到細胞膜上，而且內含體的酸化對這一過程并不是必需的。百日咳毒素預處理不僅能抑制煙酸對forskolin引起的胞內cAMP含量升高的抑制，還能抑制煙酸介導的胞內鈣流以及GPR109A受體的內吞。
　　 通過缺失和定點突變，我們發(fā)現(xiàn)

3、GPR109A羧基端在調控受體從內質網(wǎng)轉運到細胞膜上，以及受體內吞、失敏及其自身活化方面扮演非常重要的角色?！?95-314突變體完全不能定位到細胞膜上而位于內質網(wǎng)中，而且不會介導激動劑引發(fā)的信號轉導?！?15-328突變體介導的信號轉導與野生型(WT)的受體相似，但其內吞和失敏卻受到顯著的影響。通過逐步定點突變，我們發(fā)現(xiàn)絲氨酸和蘇氨酸簇(326STS328)在受體的內吞、失敏以及arrestin3轉運到細胞膜上起到關鍵的調控作用?！?

4、29-343突變體與野生型GPR109A相似，配體刺激后會快速發(fā)生內吞，然而出乎意料的是，該突變交體還能通過配體非依賴性的途徑發(fā)生內吞。
　　 幾乎所有的GPCR都會通過MAPK傳遞信號，MAPK是重要的細胞調控因子，調控許多重要的生理過程如細胞的生殖、生長、分化、凋亡等。利用細胞外源性表達GPR109A的CHO-K1以及內源性表達GPR109A的A431細胞，我們發(fā)現(xiàn)GPR109A能介導ERK1/2快速的，PTX敏感的磷酸化。

5、通過時間梯度研究，我們發(fā)現(xiàn)PKC激酶主要調控GPR109A介導的早期ERK1/2的活化，而EGFR轉激活則參與整個GPR109A介導的ERK1/2磷酸化。通過過量表達Gβγ拮抗劑βARK1-CT andα-transducin，我們發(fā)現(xiàn)Gβγ在調控GPR109A介導的ERK1/2活化過程中起到非常重要的調控作用。另外，利用arrestin-2/3 SiRNA特異性沉默穩(wěn)定表達GPR109A的HEK293細胞內arrestin-2/3蛋白

6、，我們發(fā)現(xiàn)arrestin-2/3并不參與調控GPR109A介導的ERK1/2的活化。
　　 通過上述研究，我們闡明了人煙酸受體GPR109A受體內吞的詳細機制，其羧基端對受體定位、內吞、失敏、arrestin3結合以及自身活化的調控，以及其調控ERK1/2磷酸化的途徑。在此基礎之上，我們希望通過后續(xù)實驗進一步闡明GPR109A介導的降低血脂和引起皮膚潮紅的詳細機理，為開發(fā)更加高效而同時不會引起皮膚潮紅的降血脂藥物提供理論基礎。