一種基于HMBS FRET-qPCR的哺乳動(dòng)物DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.pdf

1、垂篁董!二登墨主旦竺堡墨￡墮!旦￡墾墾盟墮塾墊塑型壘凼塑絲塑塑蕉型墨墊笪壟皇墾墮旦I一種基于HMBSFRETqPCR的哺乳動(dòng)物DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應(yīng)用中文摘要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)作為一種特異靈敏的分子診斷工具，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。然而從樣品采集、運(yùn)輸、保存、核酸提取到PCR檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程中都可能存在一些因素，影響被檢核酸的質(zhì)量和水平，造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性或假

2、陰性。為提高PCR檢測(cè)結(jié)果的可信度，非常有必要建立一種內(nèi)源性內(nèi)部控制(endogenousinternalcontrol，EIC)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)從樣品采集到PCR檢測(cè)的全程質(zhì)量監(jiān)控。在本論文的研究一，我們?cè)O(shè)計(jì)了一套針對(duì)哺乳動(dòng)物羥甲基膽色烷合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，HMBS)基因的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)定量PCR(quantit

3、ativePCR，qPCR)的EIC系統(tǒng)。在研究二及研究三，應(yīng)用建立的EIC作為質(zhì)量控制系統(tǒng)，保證分子檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信性，從而開展對(duì)哥斯達(dá)黎加和尼加拉瓜的七種蟲媒疾病的分子流行病學(xué)調(diào)查。本研究建立的EIC系統(tǒng)可擴(kuò)增人和12種哺乳動(dòng)物(犬、貓、牛、小鼠、豬、驢、馬、猴子、綿羊、山羊、獅子、獵豹)、小鼠的11種組織或臟器(心、肝、腦、脾、肺、脂肪、腎、肌肉、毛發(fā)、骨、皮膚)的DNA。此方法也可方便地用于蚊子的吸血體積及對(duì)應(yīng)血液的宿主來(lái)

4、源的判定。蚊子樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研宄采集的蚊子吸取了6種哺乳動(dòng)物的血液。本系統(tǒng)的靈敏度高(005ng組織或05n1血液／反應(yīng)體系)、特異性好，并可區(qū)別不同的哺乳動(dòng)物物種，因此可成為哺乳動(dòng)物核酸PCR檢測(cè)的理想EIC系統(tǒng)，同時(shí)也是研究吸血節(jié)肢動(dòng)物的有用工具。蟲媒疾病為熱帶地區(qū)犬發(fā)病和死亡的重要原因，但是關(guān)于這類疾病在中美洲地區(qū)的流行信息卻十分有限。本研究應(yīng)用了FRETqPCR檢測(cè)犬的全血核酸樣本，調(diào)查七種蟲媒疾病在尼加拉

5、瓜和哥斯達(dá)黎加犬中的流行情況。在尼加拉瓜，犬全血核酸樣本(n=39)攜帶有5種病原體：貓立克次體(陽(yáng)性率5％)、巴貝斯蟲(26％)、犬肝簇蟲(51％)、扁平無(wú)漿體(13％)、犬埃立克次體(56％)，而貝納柯克斯體及犬心絲蟲的檢測(cè)結(jié)果為陰性。其中共有30只犬(80％)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，12只(3l％)攜帶一種病原體，11只(28％)攜帶兩種病原體，3只(8％)攜帶三種病原體，4只(10％)攜帶四種病原體。在哥靳達(dá)黎加，犬全血核酸樣本(n=4

6、0)中沒(méi)有檢測(cè)到貓立克次體及貝納柯克斯體的核酸，但另外5種蟲媒疾病病原體的檢測(cè)結(jié)果分別為：犬心絲蟲(陽(yáng)性率225％)、犬肝簇蟲(375％)、巴貝斯蟲(25％)、扁平無(wú)漿體(75％)、犬埃立克次體(50％)。9只犬魚墮董!二壁莖堅(jiān)叢旦￡墮!：堡￡墾墾盟墮塾墊塑旦塑壘墮塑堡凼壑堡型墨塹塑壅皇墾墮旦IIIUseofauniversalhydroxymethylbilanesynthase(HMBS)basedFRETqPCRasanendog

7、enousinternalcontrolformammalianDNAsanditsapplicationAbstractAsaspecificandsensitivemoleculardetectiontool，thepolymemsechainreaction(PCR)hasbeenwidelyusedonbiologicalresearchareasworldwideHowever，itiswellknownthatmanyfac

8、torscanadverselyinfluencethequantityandqualityofDNAandresultinfalsepositivityornegativityduringthewholeprocessofsamplecollection，transportation，conservation，DNAextractionandPCRdetectionTherefore，thereisanurgentneedtodeve

9、lelopanendogenousinternalcontrol(EIC)systemfordynamicmonitoringofthequalityandquantityofDNAsforPCRsInstudyoneofthisthesis，wedesignedandvalidatedafluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)quantitativePCR(qPCR)targetingthem

10、ammalianhomologofthehydroxymethylbilanesynthase(HMBS)geneasanEICforPCRsonmammalsInstudiestwoandthree，E1CwasappliedtomonitorthequalityandquantityoftestedDNAsduringthemolecularepidemiologicalinvestigationofsevenvectorborne

11、diseasesindogsfromNicaraguaandCostaRicaThedesignedEICcoulddetectwholebloodofhumanandother12mammalianspecies(dog，cat，cattle，mouse，pig，donkey，horse，monkey，sheep，goat，lionandcheetah)collectedfrom8countriesandtheHMBSgenein11

12、murineorgans／tissues(heart，liver，brain，spleen，lung，adipose，kidney，muscle，hair，honeandskin)Itwasalsousedconvenientlyonmosquitoestodeterminethevolumesofmammalianbloodmeals，anddeterminethemammalianspeciesfromwhichwholeblood

13、wasobtainedSequencingofampliconsobtainedfrommosquitoesinthisinvestigationrevealedtheyhadingestedbloodfromsixmammals，TheFRETqPCRprovedhighlysensitive(onegenecopyinO05ngtissueor05nlwholeblood／reaction)andspecificwithnofals

14、enegativeorpositiveresultsThehighsensitivityandspecificityoftheFRET—qPCRanditsabilitytodifferentiatemammalianspeciesmakesitanidealEICforPCRsinvolvingmammalsandausefultoolforhematophagousinsectstudiesThoughvector—bornedis