發(fā)光桿菌中新型雙元毒素細胞毒性研究.pdf

1、發(fā)光桿菌（Photorhabuds luminescens）是一種兼性厭氧的腸桿菌科細菌，與昆蟲病原線蟲異小桿屬互惠共生，屬昆蟲病原線蟲共生菌。自然狀態(tài)下，發(fā)光桿菌存在于侵染期線蟲腸道內，隨線蟲侵入寄主昆蟲而進入昆蟲血腔，在血腔內迅速繁殖，產生毒素和抑菌物質，使昆蟲患敗血癥死亡。隨著發(fā)光桿菌基因組測序的完成，該類細菌中重要功能蛋白和次級代謝產物的研究越來越受到關注。
　　 致病桿菌(Xenorhabdus)與發(fā)光桿菌同屬于昆蟲病

2、原線蟲共生菌，兩種細菌在形態(tài)變異、生存環(huán)境、致病機理上存在許多相似之處。最近的研究報道，致病桿菌中xaxAB基因（登錄號:DQ249320）編碼的雙元毒素能引起昆蟲細胞和腫瘤細胞的凋亡，并對家兔血紅細胞具有溶血作用。通過分析P.luminescens TT01全基因組序列，發(fā)現(xiàn)plu1961和plu1962基因編碼產物的氨基酸序列與XaxA和XaxB的相似性分別達到76.8％和74.9％。研究Plu1961和Plu1962的生物活性以及

3、它們在發(fā)光桿菌定植、入侵、毒性發(fā)揮中的功能具有重要意義。
　　 本研究從P.luminescens TT01中PCR擴增了plu1961和plu1962基因，分別構建了單獨表達載體pET-plu1、pET-plu2和共表達載體pET-pluBi。將構建的三個重組質粒分別電轉至E.coli BL21(DE3)菌株中獲得三株重組菌株:單獨表達Plu1961菌株BL21(plu1)，單獨表達Plu1962菌株BL21(plu2)和Pl

4、u1961/Plu1962共表達菌株BL21(pluBi)。經(jīng)IPTG誘導，三株重組菌中分別表達可溶性的目的蛋白。利用親和層析純化目的蛋白，并進行透析除鹽。將純化的蛋白對樅色卷蛾中腸細胞CF-203/2.5進行細胞毒性檢測，實驗結果顯示:單獨加入Plu1961或Plu1962蛋白時，CF-203細胞形態(tài)沒有明顯變化，而兩者混合后能引起CF-203細胞的溶脹、破裂。利用免疫熒光技術，我們發(fā)現(xiàn)雙元毒素處理24 h的CF-203細胞出現(xiàn)了微管

5、部分解聚和細胞膜通透性增加的現(xiàn)象。MTT實驗結果表明，只有Plu1961/Plu1962混合物才能導致CF-203細胞死亡，最高致死率達到94％。殺蟲活性研究表明，Plu1961、Plu1962蛋白單獨作用時對供試昆蟲沒有毒性，而Plu1961/Plu1962共表達產物對甜菜夜蛾四齡幼蟲具有注射毒性。以上實驗結果表明:Plu1961/Plu1962是一對新型的雙元毒素，只有兩者同時存在的情況下才表現(xiàn)出細胞毒性和殺蟲活性。
　　

6、為了研究Plu1961/Plu1962雙元毒素對CF-203細胞的可能作用機制，我們采用“Honcest和PI雙染方法”對毒素處理后的細胞進行了激光共聚焦檢測。經(jīng)Plu1961/Plu1962雙元毒素處理后的CF-203細胞中觀察到明亮的紅色和藍色熒光。同時，雙元毒素處理后的CF-203細胞中沒有檢測到DNA梯狀條帶。這表明Plu1961/Plu1962雙元毒素能夠誘導CF-203細胞的壞死。
　　 盡管Plu1961和Plu1

7、962體外混合物對昆蟲中腸細胞具有很高的毒性，但是對所測試的哺乳動物腫瘤細胞沒有明顯作用。但是，當Plu1961和Plu1962在大腸桿菌中共表達時，對B16、4T1和Hela表現(xiàn)出較高的細胞毒性。利用Native-PAGE和質譜鑒定，表明Plu1961/Plu1962在大腸桿菌BL21(DE3)中共表達時存在相互作用，而這種相互作用是對腫瘤細胞毒性必需的。
　　 本研究對Plu1961/Plu1962新型雙元毒素的殺蟲活性和細