擬南芥磷轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白PHT11在細(xì)胞質(zhì)膜上的單分子活體動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、磷轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白PHT1;1作為磷轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的一個(gè)重要成員，在調(diào)節(jié)植物對(duì)磷的吸收中有重要的生物學(xué)意義。研究表明，植物缺磷時(shí)促進(jìn)PHT1;1蛋白在細(xì)胞膜上大量積累，而且PHT1;1胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)受到多種生物學(xué)機(jī)制的調(diào)控。但是有關(guān)PHT1;1在細(xì)胞質(zhì)膜上的動(dòng)態(tài)行為卻鮮有報(bào)道。本文運(yùn)用可變角度的全內(nèi)反射熒光顯微鏡，同時(shí)結(jié)合單顆粒示蹤技術(shù)(SPT)和熒光漂白步數(shù)分析等單分子技術(shù)，在活體狀態(tài)下對(duì)不同磷濃度處理的PHT1;1在擬南芥細(xì)胞質(zhì)膜上的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了

2、研究。
　　我們將帶有GFP標(biāo)簽的PHT1;1轉(zhuǎn)基因擬南芥作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示，PHT1;1定位在擬南芥幼苗根部的細(xì)胞質(zhì)膜。利用全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)對(duì)PHT1;1-GFP進(jìn)行成像發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在低磷處理下PHT1;1在細(xì)胞膜上的表達(dá)量較高，蛋白密度較大;而在高磷處理下，PHT1;1在細(xì)胞膜上的密度變小。
　　通過(guò)全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)結(jié)合單顆粒示蹤技術(shù)對(duì)正常生長(zhǎng)條件下的擬南芥進(jìn)行分析表明，PHT1;1-G

3、FP在細(xì)胞質(zhì)膜上存在4種運(yùn)動(dòng)模式，分別是:布朗運(yùn)動(dòng)、定向運(yùn)動(dòng)、受限運(yùn)動(dòng)和混合運(yùn)動(dòng)。應(yīng)用Origin軟件對(duì)獲得的時(shí)問(wèn)序列圖像經(jīng)過(guò)高斯函數(shù)擬合分析PHT1;1在質(zhì)膜上的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括質(zhì)膜停留時(shí)間、擴(kuò)散系數(shù)、擴(kuò)散范圍等。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，低磷處理使PHT1;1在細(xì)胞質(zhì)膜上的停留時(shí)間延長(zhǎng)，而高磷處理使其停留時(shí)間變短。在對(duì)照條件下，PHT1;1的擴(kuò)散系數(shù)呈雙峰分布，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)較快和運(yùn)動(dòng)較慢兩個(gè)擬合峰。低磷處理后，PHT1;1擴(kuò)散較慢的擬合峰消

4、失，而高磷處理下擴(kuò)散較快和擴(kuò)散較慢的兩個(gè)擬合峰值均小于對(duì)照。對(duì)擴(kuò)散范圍的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，低磷處理使PHT1;1的擴(kuò)散范圍減小，而高磷處理使PHT1;1的擴(kuò)散范圍增加。總之，與對(duì)照相比，低磷處理使PHT1;1在細(xì)胞膜上的運(yùn)動(dòng)速度加快，而高磷處理使其運(yùn)動(dòng)減慢。
　　為了分析PHT1;1在質(zhì)膜上的動(dòng)態(tài)分布與質(zhì)膜微區(qū)的關(guān)系，我們應(yīng)用固醇抽提劑MβCD破壞膜微區(qū)，通過(guò)可變角度的全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀測(cè)分析PHT1;1在質(zhì)膜上運(yùn)動(dòng)的影

5、響。在不同磷濃度處理下，與對(duì)照相比，MβCD處理使PHT1;1蛋白的質(zhì)膜停留時(shí)間、擴(kuò)散系數(shù)以及擴(kuò)散范圍均變大。我們的結(jié)果表明，質(zhì)膜微區(qū)可能參與外源磷處理下磷轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在質(zhì)膜上的運(yùn)動(dòng)。
　　我們又通過(guò)PIF(Progressive Idealization and Filtering)技術(shù)對(duì)PHT1;1寡聚化狀態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在不同磷濃度處理下，PHT1;1在細(xì)胞質(zhì)膜上主要以單體和二聚體的形式存在，其中單體形式的比例高于二聚體

6、，而且在高磷處理下，二聚體的比例要高于對(duì)照。
　　綜上所述，借助高時(shí)空分辨率的單分子成像技術(shù)對(duì)不同磷濃度處理?xiàng)l件下擬南芥磷轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白PHT1;1在質(zhì)膜上的動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。
　　通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):
　　(1) PHT1;1主要定位于細(xì)胞膜，而且在細(xì)胞膜上存在4種運(yùn)動(dòng)模式;
　　(2)低磷處理使PHT1;1在細(xì)胞質(zhì)膜上的運(yùn)動(dòng)速度加快;
　　(3)膜微區(qū)抽提劑MβCD處理，使PHT1;1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比對(duì)照（相同溶劑處理