利用重組大腸桿菌進(jìn)行高分子量蜘蛛牽引絲蛋白2高效生產(chǎn)的研究.pdf

1、蜘蛛牽引絲由大壺狀腺分泌形成，擁有卓越的力學(xué)性能；是一種在工業(yè)及生物醫(yī)藥方面極具應(yīng)用前景的生物材料。天然蜘蛛牽引絲主要由兩種高分子量蛋白構(gòu)成，蜘蛛牽引絲蛋白1和2（major ampullate spidroin1 and2），文獻(xiàn)信息表明前者對蜘蛛牽引絲的剛性性能起重要作用，后者主要負(fù)責(zé)彈性性能。由于蜘蛛攻擊性強(qiáng)的天性，通過大規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)很難獲得大量蜘蛛牽引絲。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，異源生產(chǎn)蜘蛛牽引絲蛋白的方式受到越來越多研究者的

2、關(guān)注。但是由于該蛋白分子量大、序列高度重復(fù)且甘氨酸含量高的特點(diǎn)，目前其產(chǎn)量普遍較低；并且關(guān)于蜘蛛牽引絲蛋白2的表達(dá)研究較少。本文根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對蜘蛛牽引絲蛋白2的核心重復(fù)片段進(jìn)行基因設(shè)計，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了不同分子量重組蜘蛛牽引絲蛋白2的表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)。通過將蛋白誘導(dǎo)溫度由30℃降低到16℃，顯著提高了分子量從28.3-256.5 kDa的重組蜘蛛牽引絲蛋白2的表達(dá)水平；而改變誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機(jī)和培養(yǎng)基成分并沒有顯著提

3、高該蛋白的表達(dá)量。通過對蛋白表達(dá)過程中質(zhì)粒的維持性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)可能是由于低溫誘導(dǎo)條件下重組菌的質(zhì)粒維持性提高使得目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平得到了顯著提升。低溫誘導(dǎo)策略對于高分子量蜘蛛牽引絲蛋白1表達(dá)水平的提高也有顯著效果。實(shí)驗(yàn)中以代謝改造工程菌（含有能夠提高胞內(nèi)glycyl-tRNA含量的質(zhì)粒）為宿主細(xì)胞進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步提高了分子量為201.6 kDa重組蜘蛛牽引絲蛋白2的產(chǎn)量。隨后在3.0 L反應(yīng)器中將低溫誘導(dǎo)策略與高密度發(fā)酵技術(shù)相