毛細管電泳電化學檢測赤潮毒素及DNA錯配分析.pdf

1、本工作將毛細管電泳電化學方法和酶聯(lián)免疫分析相結合,以HRP為標記酶,選擇高靈敏度的供氫體為底物,酶催化反應產物經毛細管電泳分離后用微電極進行安培檢測,實現了麻痹性貝毒(PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)和記憶缺失性貝毒(ASP)三種赤潮毒素的快速在線檢測,檢測時間由常規(guī)免疫分析1 d以上縮短至幾分鐘,操作簡便,試劑消耗量少,可滿足現場檢測要求。利用金屬離子Hg2+與Ag+分別可以結合DNA雙鏈中的兩個T堿基與C堿基的性質,以二茂鐵與Tris

2、-HCl溶液為體系,實現了DNA單堿基錯配的識別,并考察了不同錯配位點的電泳分離度。全文共分為六章。
　　 第一章為緒論,簡要地介紹了毛細管電泳技術的現況與前景,毛細管電泳電化學酶催化分析以及赤潮毒素的研究進展,并說明了本課題的意義及主要內容。
　　 第二章利用毛細管電泳電化學酶聯(lián)免疫分析檢測辣根過氧化物酶(HRP)。HRP催化H2O2氧化鄰氨基酚(OAP)生成3-氨基吩嗯嗪(AP),AP在一定條件下發(fā)生氧還反應。通過電

3、化學檢測酶促反應產物AP間接檢測HRP的含量。對HRP的最佳檢測條件進行了優(yōu)化,最后確定分離高壓為15 kv,進樣高壓與進樣時間分別是10 kv和6 s,緩沖溶液是pH=5.0濃度為1.0×10-2 mol·L-1的BR溶液。在此狀態(tài)下,游離HRP檢測限為1.09×10-12 mol·L-1(S/N=3),線性范圍為2.3×10-12_3.5×10-10 mol·L-1。
　　 第三章通過競爭模式分離了麻痹性貝毒(PSP)和腹瀉

4、型貝毒(DSP)這兩種赤潮毒素。實驗中,將一系列不同濃度的PSP抗原標準品或實際樣品(Ag)分別和定量的抗OA抗體、酶標抗原Ag*加入微富集管孵育過程中,酶標抗原Ag*與標準品或實際樣品中的抗原同限量的抗體發(fā)生競爭反應,然后進樣到毛細管中進行分離,過量的Ag*和免疫復合物[Ab-Ag*]依次到達酶促反應池后開始催化H2O2氧化底物的反應,從而在Pt電極上得到檢測,可檢測到兩個電泳峰。該方法對PSP測定的線性范圍為0.8～16.0 pg/

5、mL,檢測限為0.32 pg/mL,比酶聯(lián)免疫吸附測定光度法(ELISA)法低5倍;對DSP測定的線性范圍為1.0～50.0 pg/mL,檢測限為0.40pg/mL。用所建立的方法對毒素感染貝類樣品進行了測定,并與ELISA法進行了對照,二者相關性很好。
　　 第四章采用非競爭模式,HRP標記的記憶缺失性貝類毒素(ASP)抗體(Ab*)過量,樣品溶液在孵育后既含有HRP標記的遺忘性貝類毒素抗體-抗原結合物[Ag-Ab*],又含有

6、未反應的遺忘性貝類毒素抗體(Ab*),混合液中的遺忘性貝類毒素-酶標抗體復合物和剩余酶標遺忘性貝類毒素抗體根據遷移速率不同在分離毛細管中分成不同的區(qū)帶并順次進入反應毛細管中,經毛細管電泳分離后,分別在反應毛細管中催化緩沖液中的過氧化氫氧化底物鄰氨基酚,生成具有電化學活性的物質3-氨基吩嗯嗪,進入電化學檢測池進行檢測,可檢測到兩個電泳峰。遺忘性貝類毒素的濃度不同,形成的遺忘性貝類毒素抗原抗體結合物的量不同,催化過氧化氫氧化鄰氨基酚生成氧化

7、產物3-氨基吩嗯嗪的濃度就不同,產生不同的電化學信號,由此可對酶標遺忘性貝類毒素.抗體復合物以及貝類樣品中的遺忘性貝類毒素進行定量分析。利用非競爭模式分離了記憶缺失性貝毒(ASP),該方法對ASP測定的線性范圍為5.0～500.0 pg/mL,檢測限為.2.0 pg/mL。
　　 第五章將毛細管電泳與電化學分析相結合,實現了DNA單堿基錯配的識別,并考察了不同錯配位點的電泳分離度。利用金屬離子Hg2+與Ag+分別可以結合DNA雙

8、鏈中的兩個T堿基與C堿基的性質,當有Hg2+存在時,可以形成T-Hg2+-T相互作用;當有Ag+存在時,可以形成C-Ag+-C相互作用,從而實現單堿基T或者C錯配DNA的檢測。以二茂鐵標記物,標記在ssDNA探針上,與靶DNA雜交,生成雙鏈DNA(dsDNA),通過二茂鐵的電化學性質應用于檢測錯配DNA。
　　 第六章將毛細管電泳與電化學發(fā)光相結合,初步探討了將Ru(bpy)32+CE-ECL技術用于錯配DNA的檢測,以Ru(b

9、py)2(dcbpy)NHS為標記物,標記在ssDNA探針上,與靶DNA雜交,生成雙鏈DNA(dsDNA),通過實驗,得出運用0.02mol·L-1 pH為7.0的:PBS(含三丙胺濃度為0.02 mol·L-1)緩沖液,8 kV作為分離電壓,10 kv和10 s作為進樣電壓和進樣時間,1.1 v作為檢測電勢,900 v作為光電倍增管高壓,采取較好的避光條件,可以對錯配DNA進行較好的分離檢測。檢測單堿基錯配的ssDNA的線性范圍為4.