產(chǎn)絮菌Agrobacterium tumefaciens F2利用混合碳源半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑.pdf

1、生物絮凝劑是近年來備受關(guān)注的一種無毒害、無二次污染及可生物降解的綠色凈水劑，潛在的環(huán)境效益使其在水處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前生物絮凝劑工業(yè)化生產(chǎn)面臨的主要問題是產(chǎn)量偏低及發(fā)酵方式單一?；诖?，本研究以生物絮凝劑產(chǎn)生菌Agrobacterium tumefaciensF2為研究對象，分析菌株生理水平對單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應(yīng)特性，構(gòu)建葡萄糖、半乳糖、甘露糖混合碳源的產(chǎn)量預(yù)測模型，選取菌絲球為生物質(zhì)載體固定化產(chǎn)絮菌株F2開發(fā)新型發(fā)酵

2、方法。
　　首先考察了產(chǎn)絮菌株Agrobacterium tumefaciensF2以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為單一碳源時的跨膜傳輸特性及磷酸化反應(yīng)速率。采用高效液相色譜法定量檢測單糖，依據(jù)細胞反應(yīng)動力學、酶促反應(yīng)米氏方程、滲透系數(shù)等基本理論，考察不同初始濃度對菌株生理水平跨膜及磷酸化反應(yīng)速率的影響。結(jié)果表明，在25 mmol/L-150mmol/L濃度范圍內(nèi)，100 mmol/L的跨膜傳輸速率最佳，發(fā)酵至18 h達到最大值，單糖跨

3、膜傳輸?shù)闹萍s因素是細胞膜載體蛋白的結(jié)合能力及胞外底物濃度；三種單糖初始濃度在10-30 mmol/L條件下，半乳糖磷酸化反應(yīng)速率低于葡萄糖和甘露糖的數(shù)值，證明產(chǎn)絮菌株F2細胞中的半乳糖激酶活性低于己糖激酶；滲透系數(shù)隨初始底物濃度增加逐漸降低，24 h達到最大值，與各單糖跨膜傳輸速率是相輔相成、相互制約的整體。
　　通過產(chǎn)絮菌株F2利用單一碳源葡萄糖、半乳糖、甘露糖及三種單糖的混合碳源的生長動力學分析，明確三種單糖混合發(fā)酵的最佳初始

4、濃度為9 g/L，配比為5:1:3。采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建三種單糖初始濃度對應(yīng)絮凝效能、絮凝劑產(chǎn)量的預(yù)測模型，優(yōu)化所得最優(yōu)解分別是葡萄糖6.59 g/L、半乳糖1.32 g/L、甘露糖3.57 g/L，預(yù)測絮凝效能及產(chǎn)量最大值為96.91％和2.93 g/L，顯著高于單一碳源發(fā)酵的產(chǎn)量(1.78 g/L)；經(jīng)柱前衍生化方法測定三種單糖混合發(fā)酵時的利用規(guī)律，結(jié)合生長曲線可知，在對數(shù)期前期，葡萄糖為菌株的主要產(chǎn)能碳源，在對數(shù)期后期(14-18

5、 h)及穩(wěn)定期前期(18-26 h)三種單糖直接合成大量絮凝劑，24 h產(chǎn)量達最大值(2.93 g/L)，這是由產(chǎn)絮菌株 F2對單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應(yīng)特性決定的。計算產(chǎn)絮過程的碳源轉(zhuǎn)化率，混合碳源發(fā)酵的菌體生物量及多糖類聚合物分別是21%和33%，遠高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖單一碳源發(fā)酵時的轉(zhuǎn)化率(菌體轉(zhuǎn)化率約10%，絮凝劑轉(zhuǎn)化率20%左右)。全部結(jié)果證明混合碳源發(fā)酵可促進菌株合成絮凝劑的產(chǎn)量及碳源轉(zhuǎn)化率提高。
　　以黑曲霉A

6、spergillus nigeY3菌絲球作為載體，實現(xiàn)了產(chǎn)絮菌株F2的固定化及半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑。菌絲球載體在產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基中生長良好，通過吸附法可成功固定化產(chǎn)絮菌株F2，經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接后球體形態(tài)穩(wěn)定，且附著的細菌生物量逐漸增多，歸功于產(chǎn)絮菌分泌的多糖絮凝劑，單批次發(fā)酵的吸附量約為8.75×109 cfu/g菌絲球干重。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化固定化發(fā)酵的培養(yǎng)條件，最優(yōu)結(jié)果是接種量8%，發(fā)酵時間27h，經(jīng)驗證可得3.24 g/L的絮凝劑，相

7、較于游離發(fā)酵的產(chǎn)量(2.93 g/L)提高了近10%。進一步優(yōu)化了絮凝劑干粉的絮凝條件，預(yù)測最佳結(jié)果是干粉投加量0.03 g/L，CaCl2投加量1mL/L，環(huán)境pH=8，絮凝效能可達97.98%，經(jīng)反復(fù)驗證證明兩個模型具有較高的精準度。分析了固定化發(fā)酵單周期的產(chǎn)絮效能，菌體生長周期與游離發(fā)酵基本保持一致，26 h可收獲最大產(chǎn)量(3.35 g/L)。將固定化產(chǎn)絮菌的菌絲球連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果證實至少可轉(zhuǎn)接30個周期(24 h/周期)，并可

8、同時保證菌體生物量、絮凝效能及絮凝劑產(chǎn)量三者的穩(wěn)定性。
　　綜上所述，為促進產(chǎn)絮菌株F2的產(chǎn)量提高及開發(fā)新型發(fā)酵方法，本研究圍繞菌株對葡萄糖、半乳糖、甘露糖的利用規(guī)律，構(gòu)建葡萄糖、半乳糖、甘露糖三者混合使用時的產(chǎn)量預(yù)測模型，并以菌絲球為生物質(zhì)載體實現(xiàn)了固定化產(chǎn)絮菌株F2的半連續(xù)發(fā)酵。意義在于提高了產(chǎn)絮菌株F2的碳源轉(zhuǎn)化率及絮凝劑產(chǎn)量，為混合碳源制備生物絮凝劑奠定基礎(chǔ)；半連續(xù)發(fā)酵方法可有效保證發(fā)酵系統(tǒng)的菌體生物量、增強菌體抗性、免除