染料修飾殼聚糖親和吸附劑的制備及其在蛋白純化中的應(yīng)用.pdf

1、血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，它有許多重要的生理功能。一直以來，血清白蛋白都被作為一種模型蛋白質(zhì)而大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域。同時，由于它在血液蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)方面的快速發(fā)展，血清白蛋白的分離研究已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。 染料配體親和色譜是一種高效簡便的蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)，染料配體價格便宜，易于合成，能通過共價鍵牢固的結(jié)合到親和載體上，與蛋白質(zhì)的結(jié)合容量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易為生物降解，從而越來越多地取代了天然生物配體

2、，成為最有潛力的一類親和配體，在大規(guī)模純化方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 甲殼素是自然界中含量僅次于纖維素的天然多糖，其脫乙?；a(chǎn)物殼聚糖是一種來源豐富的環(huán)境可再生資源，具有無毒、無味、生物可降解和生物相容性等特性，它們被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、污水處理、生物醫(yī)藥、食品、造紙、日用化工等許多領(lǐng)域，國內(nèi)外已進(jìn)行了較為深入的研究。近年來國內(nèi)外學(xué)者對這類資源的改性及應(yīng)用也做了不少工作，不斷開發(fā)它在生物和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用。但是，文獻(xiàn)報導(dǎo)的染料修

3、飾的交聯(lián)殼聚糖微球(或膜)對白蛋白的吸附量不是很大，分析其原因，一方面是由于吸附劑負(fù)載染料配體的量不夠高，另一方面是由于血清白蛋白的分子量較大，占有較大的體積空間，染料配體如僅僅存在于微球的表面，由于位點-位點隔離效應(yīng)(site-siteiso1ation)會影響其對蛋白分子的吸附。 本文將制備的交聯(lián)殼聚糖微球作為一種親和基質(zhì)材料，三嗪染料作為親和配體，兩者偶聯(lián)后得到一種新型的染料配體親和吸附劑，并將其用于蛋白質(zhì)的純化分離，主要

4、做了以下研究工作： 首先，本文以戊二醛作交聯(lián)劑，采用反相懸浮交聯(lián)法制備交聯(lián)殼聚糖微球(CS)，為了增強(qiáng)殼聚糖微球上的氨基含量，在制備過程中用甲醛對殼聚糖上的游離氨基進(jìn)行保護(hù)，并研究了一些制球的影響因素。實驗表明，在殼聚糖乙酸溶液濃度為3-5％，油水比為1/1，改變交聯(lián)劑戊二醛的用量，可得到性能較好的殼聚糖微球樹脂。并用紅外光譜儀和掃描電子顯微鏡(SEM)對殼聚糖樹脂進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，本實驗制得的殼聚糖樹脂呈很好的球形，粒徑在

5、150-250μm。 考慮到染料配體與蛋白之間的空間位阻效應(yīng)，同時也為了進(jìn)一步增強(qiáng)殼聚糖微球上活性基團(tuán)的含量，也就是提高微球上的氨基含量，本文在殼聚糖微球的分子結(jié)構(gòu)中分別引入了羥丙基和胺基，作為染料配體與基質(zhì)之間的間隔臂，制備一系列在空間手臂末端以及殼聚糖微球表面均具有游離胺基的交聯(lián)殼聚糖微球(HDA-CS)。以HDA-CS微球為基質(zhì)，偶聯(lián)兩種染料配體CibacronBlueF3GA(簡稱CBF)和ProcionBlueMX-R

6、(簡稱PBM)，制得了兩種染料親和吸附劑CBF-HDA-CS和PBM-HDA-CS，通過硫元素分析的測定，以及紅外光譜儀和掃描電子顯微鏡的表征，證明了染料的偶聯(lián)反應(yīng)是成功的。值得注意的是，相比于CBF-CS微球，有間隔臂的CBF-HDA-CS微球有較高的染料結(jié)合量；相比于單氯染料CBF，雙氯染料PBM具有更高的反應(yīng)活性，從而有較高的染料結(jié)合量。同時研究了該染料吸附劑配體密度的控制以及染料泄漏率等。 其次，以CBF-HDA-CS和

7、PBM-HDA-CS為親和吸附劑，研究了其對牛血清白蛋白(BSA)的吸附性能。實驗表明，兩種親和吸附劑對BSA的吸附最佳pH值為5.0，離子強(qiáng)度增大會顯著降低BSA的吸附量。兩種親和吸附劑對BSA的吸附行為遵循Langmuir吸附模型，CBF-HDA-CS對BSA的理論飽和吸附量(qm)為108.7mg/g；PBM-HDA-CS為50.3mg/g。結(jié)果表明，相較于文獻(xiàn)報導(dǎo)的殼聚糖染料親和吸附劑，CBF-HDA-CS有較高的BSA吸附量。

8、考察了幾種洗脫劑的洗脫性能，發(fā)現(xiàn)pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液(含1.0MNaSCN)能將BSA很好的洗脫下來，洗脫率高達(dá)99％。采用圓二色譜法研究了緩沖溶液中離子強(qiáng)度(NaCl調(diào)節(jié))對BSA構(gòu)象的影響，結(jié)果表明，BSA的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。 最后，以CBF-HDA-CS為親和吸附劑，選取染料配體含量為494μmol/g，研究了其對人血清白蛋白(HSA)的吸附性能。實驗表明，CBF-HDA-CS對HSA的吸附最佳pH值為

9、5.0，吸附量達(dá)到最大值79.8mg/gwetbeads，離子強(qiáng)度增大會顯著降低HSA的吸附量。測得了吸附等溫線，發(fā)現(xiàn)CBF-HDA-CS對HSA的吸附行為遵循Langmuir吸附模型，對HSA的理論飽和吸附量(qm)為89.3mg/g?？疾炝藥追N洗脫劑的洗脫性能，發(fā)現(xiàn)pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液(含1.0MNaSCN)能將HSA很好的洗脫下來，洗脫率高達(dá)100％。經(jīng)過五個吸附-洗脫周期后，吸附劑的吸附量僅減少了4.9％，證明此