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文檔簡(jiǎn)介
1、甘藍(lán)型油菜是世界上重要的油料作物,利用隱性雄性不育授粉系統(tǒng)制備強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種是甘藍(lán)型油菜育種的重要內(nèi)容。本研究通過石蠟切片和掃描電鏡對(duì)甘藍(lán)型油菜隱性雜合兩型系SLA和SLB花藥發(fā)育的特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析,初步確定不育系SLA發(fā)生敗育的類型和時(shí)期。利用NGS技術(shù)對(duì)兩型系SLA和SLB進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和基因組重測(cè)序分析,在基因組水平上分析SLA和SLB之間的遺傳變異;用轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR方法篩選在SLA和SLB中的差異表達(dá)基因;應(yīng)用在線分析軟件
2、 Venny比較分析轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因和重測(cè)序發(fā)生變異的基因,確定與花藥敗育相關(guān)的候選基因。其主要結(jié)果如下:
掃描電鏡分析結(jié)果顯示:不育系SLA的花藥顯著小于可育系SLB,整個(gè)發(fā)育過程花藥無(wú)明顯的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。當(dāng)花蕾大小為2mm時(shí),不育系 SLA和可育系 SLB花藥表層細(xì)胞無(wú)顯著差異;花蕾大小為4mm時(shí),不育系 SLA花藥表層細(xì)胞開始塌陷萎縮,背面細(xì)胞排列緊密;當(dāng)花蕾開放后,不育系SLA花藥細(xì)胞完全萎縮、退化,花粉囊不能正常開裂釋
3、放花粉。不同發(fā)育期花蕾石蠟切片甲苯胺藍(lán)染色的細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示:在四分體時(shí)期,不育系 SLA和可育系 SLB的花藥存在顯著差異,SLA的絨氈層細(xì)胞高度液泡化,不能皺縮、轉(zhuǎn)化為分泌型;隨后在小孢子發(fā)育過程中逐漸降解消失,不能正常發(fā)育為成熟小孢子。因此,不育系SLA發(fā)生敗育主要原因可能是在四分體時(shí)期或四分體之前絨氈層細(xì)胞的發(fā)育異常而導(dǎo)致。
通過對(duì)兩型系SLA和SLB花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析,共獲得101個(gè)在不育材料SLA中顯著上調(diào)表達(dá)的
4、差異基因。采用GO功能分類將三個(gè)類別中已注釋基因劃分為25個(gè)功能類別。101個(gè)差異表達(dá)基因中,在分子功能方面富集最多,有55個(gè)基因發(fā)生富集,主要在離子結(jié)合、電子載體活性等能量代謝相關(guān)代謝過程;在生物過程方面有44個(gè)基因發(fā)生富集,主要在碳水化合物代謝、蛋白水解、抗氧化反應(yīng)等條目中;在細(xì)胞成分方面富集到2個(gè)基因,主要在胞外部分的條目中,說明甘藍(lán)型油菜育性調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物過程。KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因僅在苯丙烷代謝途徑中顯著
5、富集,共有4個(gè)顯著差異表達(dá)基因,包括1個(gè)ACOS5基因(BnaC09g10950D)和3個(gè)過氧化物酶家族基因(BnaA01g01280D、BnaA07g01880D、BnaC01g02300D),說明苯丙烷代謝途徑在不育系SLA發(fā)生敗育過程中起重要作用。
通過對(duì) SLA和 SLB全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)比較分析,在整個(gè)基因組中檢測(cè)到119,863個(gè)SNP位點(diǎn)和18,370個(gè)Indel變異位點(diǎn),這些變異位點(diǎn)大部分發(fā)生在基因間或內(nèi)含子等
6、非編碼區(qū)域,在各條染色體上的分布存在差異性。根據(jù)變異位點(diǎn)在參考基因組上對(duì)應(yīng)的基因物理位置,共注釋到影響基因表達(dá)或者功能的錯(cuò)義突變、移碼突變等變異的基因14,705個(gè);同時(shí)針對(duì)這些變異基因進(jìn)行GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)這些基因主要在核苷結(jié)合、碳水化合物衍生物結(jié)合、有機(jī)物代謝過程通路等條目發(fā)生富集。
綜合轉(zhuǎn)錄組和全基因組重測(cè)序結(jié)果,共檢測(cè)到11個(gè)育性關(guān)鍵差異表達(dá)基因,其中3個(gè)基因(BnaA03Rf-4、BnaA10Rf-7、BnaC0
7、5Rf-10)存在2種以上位點(diǎn)變異類型。另外,在內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生變異的基因有4個(gè)(BnaA03Rf-3、BnaA04Rf-5、BnaA10Rf-6、BnaAnnRf-8),發(fā)生同義突變基因2個(gè)(BnaA03Rf-4、BnaC03Rf-9),在上游或下游區(qū)域發(fā)生變異的有6個(gè)基因(BnaA01Rf-1、BnaA02Rf-2、BnaA03Rf-4、BnaA10Rf-7、BnaC05Rf-10、BnaC07Rf-11)。qRT-PCR結(jié)果顯示11
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