溶酶體、線粒體靶向定位的雙光子極性熒光探針.pdf

1、極性是化學(xué)化工生產(chǎn)中的一種重要參數(shù)，一些特定的無(wú)機(jī)有機(jī)反應(yīng)均依賴(lài)于極性的參與。在生物系統(tǒng)里，尤其在細(xì)胞層面上，極性屬于微環(huán)境的一種重要組成部分，決定了一系列復(fù)雜的生理反饋機(jī)制和生理維護(hù)功能。許多細(xì)胞內(nèi)的生理過(guò)程都會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)的極性，如大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶的重組，細(xì)胞器膜的產(chǎn)生，免疫系統(tǒng)的應(yīng)答以及分子的跨膜運(yùn)輸?shù)?。極性的穩(wěn)定是保證細(xì)胞正常增殖、分化、代謝和功能活動(dòng)的重要條件，而極性的異常變化與一些疾病的產(chǎn)生關(guān)系密切。因此，檢測(cè)細(xì)胞或生物體內(nèi)的

2、極性變化對(duì)于某些疾病的研究與治療具有重大的意義。
　　熒光探針是指在一定體系內(nèi)，當(dāng)一種物質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化時(shí)，熒光信號(hào)能隨之發(fā)生作出相應(yīng)變化的分子。近些年來(lái)，雙光子熒光探針憑借著自身穩(wěn)定性高，光漂白性好，生物穿透性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，使用雙光子熒光探針來(lái)檢測(cè)生命體內(nèi)極性的變化具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　溶酶體是真核細(xì)胞中的一種常見(jiàn)細(xì)胞器，內(nèi)含50多種水解酶，能夠分解各種外源和內(nèi)源的大分子物質(zhì)。在自噬過(guò)程中，自

3、噬體的膜和溶酶體膜發(fā)生融合，使自噬體內(nèi)包裹的物質(zhì)與溶酶體內(nèi)的水解酶相接觸。在這個(gè)膜融合的過(guò)程中，溶酶體的極性勢(shì)必會(huì)發(fā)生變化，而這個(gè)過(guò)程中極性信號(hào)的變化為我們提供了一個(gè)監(jiān)測(cè)自噬過(guò)程的新思路。
　　線粒體是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所。在細(xì)胞程序性凋亡過(guò)程中，線粒體的極性會(huì)隨著膜電勢(shì)的變化發(fā)生顯著的變化，檢測(cè)線粒體極性的變化對(duì)研究細(xì)胞凋亡具有重大意義。此外，在生物的

4、成長(zhǎng)周期中，不同的生長(zhǎng)階段細(xì)胞及不同組織部位細(xì)胞的線粒體極性均有差異，檢測(cè)線粒體極性的分布對(duì)研究生命的生長(zhǎng)發(fā)育具有指導(dǎo)性的作用。
　　香豆素作為一個(gè)傳統(tǒng)的“溶劑致變色”基團(tuán)，具有良好的光譜特性和水溶性，對(duì)其周?chē)娜軇O性變化很敏感，并且對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。因此，香豆素非常適合作為一個(gè)極性熒光探針的熒光報(bào)告基團(tuán)。本文從大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上出發(fā)，對(duì)香豆素母體進(jìn)行修飾改造，合成了以香豆素為母體的溶酶體、線粒體靶向定位雙光子極性熒光探針，通過(guò)質(zhì)

5、譜、核磁共振氫譜和核磁共振碳譜等表征手段對(duì)這兩種探針進(jìn)行了精確的結(jié)構(gòu)表征，并研究了其光譜性質(zhì)與溶劑極性的關(guān)系。更重要的是，通過(guò)雙光子熒光顯微技術(shù)對(duì)這兩種探針在細(xì)胞及生物體內(nèi)的應(yīng)用做出了探索，并取得了一些有意義的結(jié)果。
　　(1)簡(jiǎn)要介紹了極性熒光探針的檢測(cè)機(jī)理及其研究進(jìn)展，雙光子熒光顯微成像技術(shù)及其優(yōu)點(diǎn)。
　　(2)設(shè)計(jì)合成了溶酶體定位的雙光子極性熒光探針Lyso-OC。探針Lyso-OC分子主要包括一個(gè)7位取代的香豆素母體

6、，一個(gè)靶向溶酶體定位基團(tuán)嗎啉和一個(gè)由1-乙炔-4-甲氧基苯和酰胺結(jié)構(gòu)組成的“推-拉”電子結(jié)構(gòu)。其中，1-乙炔-4-甲氧基苯不僅為探針Lyso-OC提供了一個(gè)良好的共軛結(jié)構(gòu)，擁有了良好的雙光子性質(zhì)，還使探針Lyso-OC在對(duì)極性響應(yīng)的過(guò)程中的斯托克斯位移變的更大。更重要的是，我們采用雙光子熒光顯微技術(shù)通過(guò)探針Lyso-OC的熒光變化觀察到了自噬過(guò)程不同階段的極性變化情況，成功的監(jiān)測(cè)了細(xì)胞自噬過(guò)程。
　　(3)設(shè)計(jì)合成了溶酶體定位的雙

7、光子極性熒光探針Mito-OC。探針Mito-OC分子主要包括一個(gè)7位取代的香豆素母體，一個(gè)靶向線粒體定位基團(tuán)吡啶鹽和一個(gè)由1-乙炔-4-甲氧基苯和酰胺結(jié)構(gòu)組成的“推-拉”電子結(jié)構(gòu)。通過(guò)一系列光學(xué)測(cè)試，我們發(fā)現(xiàn)探針Mito-OC對(duì)溶劑極性的變化有著良好的比率計(jì)量響應(yīng)，可以用于定量檢測(cè)溶劑極性的變化。在MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行的細(xì)胞毒性試驗(yàn)和共定位實(shí)驗(yàn)表明，探針Mito-OC的細(xì)胞毒性很小并能很好地定位于線粒體。此外，通過(guò)雙光子共聚焦熒光成像