基于細(xì)胞芯片的表面等離子體共振成像技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用.pdf

1、在化工制藥研究中，利用表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術(shù)評(píng)價(jià)候選藥物與其作用靶點(diǎn)的結(jié)合性能，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行篩選是藥物開發(fā)的重要步驟。作為一種光學(xué)傳感方法，表面等離子體共振技術(shù)具有實(shí)時(shí)、免標(biāo)記、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但是傳統(tǒng)的SPR應(yīng)用需要先從細(xì)胞內(nèi)提取、純化目標(biāo)分子，然后將其固定修飾在傳感芯片表面，操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力；此外，離開了細(xì)胞環(huán)境，目標(biāo)分子的化學(xué)構(gòu)象及生物活性都可能發(fā)生改變，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的

2、準(zhǔn)確性。因此，本文利用基于細(xì)胞芯片的表面等離子體共振成像技術(shù)（Surface Plasmon Resonance image，SPRi）原位測量細(xì)胞表面的生物化學(xué)反應(yīng)。
　　首先，本文利用基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)研究了免疫熒光試驗(yàn)中熒光標(biāo)記分子對(duì)細(xì)胞表面生物分子結(jié)合反應(yīng)的影響，說明了免標(biāo)記技術(shù)在生物化學(xué)研究中的重要性。該章研究使用帶正電、負(fù)電及電中性的有機(jī)熒光分子標(biāo)記麥芽凝集素（Wheat Germ Agglutinin，WGA

3、），然后分別測量免標(biāo)記的WGA以及三種被標(biāo)記WGA與細(xì)胞表面糖蛋白受體分子之間的結(jié)合吸附-解離脫附過程，并通過改變?nèi)芤弘x子濃度進(jìn)一步驗(yàn)證熒光分子電荷的影響。結(jié)果表明：熒光標(biāo)記分子的電荷性質(zhì)顯著影響細(xì)胞表面配體-受體（Wheat Germ Agglutinin-Glycoprotein）分子之間的結(jié)合吸附過程以配體分子在細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的分布區(qū)域。這種影響主要來源于細(xì)胞膜本身所帶負(fù)電荷，可以促進(jìn)被正電荷熒光分子標(biāo)記的配體分子與細(xì)胞表面受體

4、分子快速結(jié)合；而細(xì)胞膜表面電荷分布不均一，也造成不同熒光分子標(biāo)記的配體分子在細(xì)胞表面結(jié)合的分布區(qū)域存在差異。
　　然后，本文通過穩(wěn)定光源溫度和鎖定傳感芯片位置，改善了實(shí)驗(yàn)裝置信噪比，實(shí)現(xiàn)了原位監(jiān)測單克隆抗體藥物分子（Herceptin）與細(xì)胞表面受體分子（Her2）之間的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程，藉此分別測量了Herceptin分子與不同細(xì)胞系細(xì)胞以及腫瘤組織原代細(xì)胞表面 Her2分子之間的鍵合反應(yīng)。結(jié)果表明：不同細(xì)胞系細(xì)胞表面，甚至同一細(xì)胞

5、系不同細(xì)胞表面 Herceptin-Her2相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)常數(shù)有明顯差異，這種差異在腫瘤組織的原代細(xì)胞表面表現(xiàn)的更加顯著。從而強(qiáng)調(diào)了免標(biāo)記單細(xì)胞研究的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
　　其次，針對(duì)在臨床治療過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)單克隆抗體藥物分子 Herceptin產(chǎn)生耐藥性的問題，本文測定了在藥物敏感和藥物耐受細(xì)胞表面，Herceptin-Her2分子間反應(yīng)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線，并通過雙通道熒光染色技術(shù)進(jìn)一步解釋藥物分子在藥物耐受細(xì)胞表面結(jié)

6、合動(dòng)力學(xué)改變的原因。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：由于粘蛋白Muc4的過度表達(dá)阻礙了部分 Herceptin-Her分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，在藥物耐受細(xì)胞表面一些Herceptin分子脫附解離速度顯著增大，無法有效作用于腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致藥物分子Herceptin的后期治療失敗。
　　最后，本文利用基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)研究了新型靶向納米藥物在細(xì)胞表面的結(jié)合性能。本章實(shí)驗(yàn)通過Protein A分子的共軛螯合作用，制備了表面修飾不同密度靶向識(shí)別分子 Her

7、ceptin的金納米顆粒（AuNP）作為靶向納米藥物（Herceptin@AuNP），再分別測定了上述納米藥物在Her2表達(dá)濃度不同的細(xì)胞表面的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：靶向納米藥物（Herceptin@AuNP）表面的識(shí)別分子（Herceptin）密度以及細(xì)胞表面目標(biāo)受體分子（Her2）的表達(dá)濃度都會(huì)顯著影響靶向納米顆粒在細(xì)胞表面的結(jié)合方式。納米顆粒（AuNP）會(huì)影響識(shí)別分子（Herceptin）與受體分子（Her2）之間的結(jié)合性能，靶

8、向納米藥物只有與受體分子（Her2）之間發(fā)生雙（多）鍵合反應(yīng)才能有效結(jié)合在細(xì)胞表面。
　　上述結(jié)論完善了基于細(xì)胞芯片的SPRi技術(shù)，拓寬了該技術(shù)的應(yīng)用范圍，強(qiáng)調(diào)了免標(biāo)記單細(xì)胞分析在生物檢測及藥物分析中的必要性和可靠性；同時(shí)也揭示了電荷對(duì)細(xì)胞表面生物化學(xué)反應(yīng)的影響、闡明了腫瘤細(xì)胞對(duì)單克隆抗體藥物產(chǎn)生耐藥性的動(dòng)力學(xué)機(jī)制、發(fā)現(xiàn)了影響靶向納米顆粒在細(xì)胞表面結(jié)合性能的主要因素。這些都有助于人類進(jìn)一步理解生化反應(yīng)的本質(zhì)、加快新型藥物開發(fā)進(jìn)度、