基于新型智能響應(yīng)水凝膠材料的便攜式定量檢測新方法.pdf

1、近年來，各種疾病的發(fā)病率居高不下，對即時(shí)診斷提出了更高的要求。與此同時(shí)，科技的進(jìn)步以及人們生活水平的提高，為即時(shí)診斷的發(fā)展創(chuàng)造了條件?；谝陨媳尘埃鞣N即時(shí)診斷方法應(yīng)運(yùn)而生，并迅速成為研究熱點(diǎn)。所謂即時(shí)診斷(Point of Care Test，POC Test)，是指在病人身旁迅速獲得檢測結(jié)果的一項(xiàng)技術(shù)手段。該技術(shù)具有成本低廉、操作簡便、實(shí)時(shí)快速、定量準(zhǔn)確、用戶友好等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療、環(huán)境檢測、食品安全等領(lǐng)域備受關(guān)注。盡管即時(shí)檢測的各

2、種創(chuàng)新型成功實(shí)例百花齊放，但目前成功的商業(yè)化產(chǎn)品案例仍十分有限，其中尤以最廣泛普及、最具有實(shí)用價(jià)值的個(gè)人用血糖儀為代表。但是，血糖儀的檢測靶標(biāo)僅局限于葡萄糖分子。為拓展血糖儀的檢測靶標(biāo)發(fā)展一套通用性強(qiáng)的檢測平臺(tái)，本文將視線投向核酸適體交聯(lián)智能水凝膠，并構(gòu)建其與血糖儀聯(lián)用檢測體系。水凝膠是一類具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能響應(yīng)多種化學(xué)、物理刺激的親水性高分子聚合物。核酸適體是20世紀(jì)90年代興起的一類能夠特異性地結(jié)合靶標(biāo)分子的新型的分析、診斷分子。

3、特別是將其與分子生物學(xué)信號放大技術(shù)結(jié)合，為解決遺傳變異、疾病診斷、治療等難題提供了新的思路，愈加成為化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并不斷向普及化、便攜化等方向發(fā)展?；诖?，本文通過DNA自組裝方法和分子識(shí)別技術(shù)，發(fā)展快速、方便、廉價(jià)的即時(shí)診斷裝置，成功地把血糖儀的檢測靶標(biāo)拓展到任何感興趣的分子。具體開展了如下幾部分工作:
　　(1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體，設(shè)計(jì)、合成、制備了核酸適體交聯(lián)三維水凝膠，理論計(jì)算并分析了凝膠結(jié)構(gòu)交聯(lián)

4、情況，以金納米粒子作為可視化信號分子考察了水凝膠成膠-解膠過程。水凝膠工作原理如下:將兩條DNA短鏈（鏈A和鏈B）與丙烯酰胺單體共聚生成線性聚丙烯酰胺聚合鏈A(PS-A)和聚合鏈B(PS-B)。其中鏈A和B分別能夠與DNA核酸適體序列l(wèi)inker aptamer的兩端互補(bǔ)。待PS-A和PS-B充分混勻后，向其中加入linker aptamer鏈。隨著核酸適體的加入，鏈A、鏈B與之雜交得到三鏈復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，作為交聯(lián)劑使得線性聚丙烯酰胺PS

5、-A和PS-B形成三維網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)，并將金納米粒子包裹于其中。外界刺激，如DNaseⅠ（非特異性）和可卡因（特異性），能夠瓦解交聯(lián)結(jié)構(gòu)，釋放出金納米粒子，并可借助肉眼觀測到凝膠結(jié)構(gòu)的改變。
　　(2)以可卡因?yàn)槟Ｐ头肿?，建立了目?biāo)響應(yīng)“sweet”水凝膠手持式傳感體系，基于DNA堿基對識(shí)別和核酸適體-靶分子相互作用之間的相互競爭過程引發(fā)的酶促反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了核酸適體交聯(lián)水凝膠與個(gè)人用血糖儀的結(jié)合。具體原理同上，以淀粉葡萄糖苷酶替代金

6、納米粒子作為信號的響應(yīng)分子。當(dāng)體系中不存在靶標(biāo)時(shí)，淀粉葡萄糖苷酶穩(wěn)定地包裹在膠中，導(dǎo)致其與膠外溶液中底物淀粉的物理分離，酶促反應(yīng)無法發(fā)生;加入靶標(biāo)后，核酸適體特異性的優(yōu)先與靶標(biāo)相結(jié)合形成靶標(biāo)-核酸適體復(fù)合體，導(dǎo)致水凝膠瓦解并釋放出淀粉葡萄糖苷酶。釋放出的酶分子催化溶液相中淀粉水解產(chǎn)生大量的葡萄糖，借由個(gè)人用血糖儀(PGM)定量讀出信號值。該方法具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，水凝膠保藏長達(dá)3個(gè)月后仍具有良好的準(zhǔn)確度。
　　(3)為了驗(yàn)證

7、方法的通用性，先后設(shè)計(jì)了針對可卡因和腺嘌呤核苷三磷酸檢測的核酸適體交聯(lián)水凝膠，分別應(yīng)用于對可卡因和腺嘌呤核苷三磷酸的定量分析。采用相同的工作機(jī)理，將高聚物鏈按照一定濃度比例制備得到包裹有淀粉葡萄糖苷酶的交聯(lián)水凝膠。核酸適體-靶標(biāo)復(fù)合物的形成導(dǎo)致水凝膠瓦解，釋放出的酶分子催化底物淀粉水解，產(chǎn)生放大的可由血糖儀讀出的葡萄糖濃度信號，從而實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測。針對緩沖體系內(nèi)可卡因的檢出限達(dá)3.8μM，針對緩沖體系內(nèi)的ATP，該方法的檢出限為15.