基于功能化石墨烯新型DNA生物傳感器的構(gòu)建及在腫瘤檢測(cè)中的研究.pdf

1、隨著工業(yè)化進(jìn)程日益加快，環(huán)境污染日漸嚴(yán)重以及人口老齡化不斷加速，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率也在快速攀升，已然成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。因?yàn)閻盒阅[瘤的早期患者所治愈的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于晚期患者,而且要節(jié)省更多的財(cái)力、人力和時(shí)間,倘若腫瘤發(fā)生能夠及時(shí)被檢測(cè)，這對(duì)于提高腫瘤治愈率和延長(zhǎng)患者生存期具有重要的臨床意義。隨著對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤等重大疾病都與遺傳基因有關(guān)。基因DNA分子的結(jié)構(gòu)序列發(fā)生微小改變，都會(huì)導(dǎo)致遺傳

2、信息的改變或疾病的發(fā)生。通過(guò)對(duì)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因序列檢測(cè)，對(duì)腫瘤的早期診斷、監(jiān)測(cè)和治療方面具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　基于納米技術(shù)、生物傳感技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù)，本研究構(gòu)建了一系列在腫瘤早期篩查和診斷中具有重要應(yīng)用前景的高靈敏電化學(xué)DNA生物傳感器。從功能化石墨烯納米材料的制備，傳感器敏感界面的構(gòu)建以及新型信號(hào)增強(qiáng)的DNA傳感器的研制，并研究新方法及其應(yīng)用等方面進(jìn)行了探索和研究，為惡性腫瘤的早期檢測(cè)以及相關(guān)研究提供新的思路。本論

3、文主要開(kāi)展的工作及結(jié)果如下：
　?、倩?GO-COOH/ CuO NWs構(gòu)建的DNA生物傳感器對(duì)肺癌相關(guān)基因CYFRA21-1的檢測(cè)
　　制備羧基功能化石墨烯（GO-COOH）以改善rGO的分散性和生物相容性，再合成氧化銅納米線（CuO NWs），并充分結(jié)合二者的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)簡(jiǎn)單的混合使其相互交織纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種方法避免了將兩者進(jìn)行復(fù)合的繁瑣合成步驟，且復(fù)合物中的CuO NWs充當(dāng)電子傳遞“導(dǎo)線”，能夠促進(jìn)電極的電子傳

4、遞速率。對(duì)所制備的GO-COOH/CuO NWs復(fù)合材料進(jìn)行SEM、TEM、EDX和FTIR表征和電化學(xué)性能測(cè)試。將5’端修飾有-NH2的CYFRA21-1探針?lè)肿油ㄟ^(guò)酰胺共價(jià)固定到GO-COOH/CuO NWs工作電極表面。采用 MB做雜交指示劑，利用ssDNA/GO-COOH/CuO NWs/PLLy/GCE構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對(duì)CYFRA21-1基因的人工合成序列進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明該傳感器在1.0×10-6~1.0×10–

5、12 mol/L的濃度范圍內(nèi)與電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)呈良好線性關(guān)系，以及良好的選擇性和穩(wěn)定性。
　?、跇?gòu)建 NG/AuNPs DNA生物傳感器并檢測(cè) HL-60人原髓白血病細(xì)胞的MDR1基因
　　采用元素?fù)诫s的方法進(jìn)一步改善石墨烯的電化學(xué)活性。對(duì)GO進(jìn)行N原子摻雜，再將Au3+原位還原到NG中，從而得到NG/AuNPs復(fù)合材料，再利用強(qiáng)烈的S-Au鍵將巰基修飾的MDR1基因探針固定在傳感器NG/AuNPs修飾電極表面。利用SEM、T

6、EM、XRD和XPS對(duì)材料的理化特性進(jìn)行了表征?；贜G/AuNPs的優(yōu)異的電催化能力和生物相容性，構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對(duì)MDR1基因人工合成序列的最低檢出限為3.12×1015mol/L。構(gòu)建的DNA生物傳感器在腫瘤實(shí)際樣品檢測(cè)中進(jìn)行了初步應(yīng)用。利用構(gòu)建的NG/AuNPs DNA生物傳感器檢測(cè)HL-60人原髓白血病細(xì)胞的MDR1基因的RT-PCR產(chǎn)物，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分子生物學(xué)中最常用的PCR法相比較，結(jié)果表明建立的NG/AuNPs

7、電化學(xué)DNA傳感器檢測(cè)方法速度更快、靈敏度更高，在臨床上實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病多藥耐藥相關(guān)基因 MDR1的檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用潛力。
　?、刍?D NG/Fe3O4構(gòu)建的新型DNA生物傳感器研究
　　在上一章的研究基礎(chǔ)上，整合2D石墨烯制備具有三維（3D）泡沫結(jié)構(gòu)的功能化石墨烯。采用環(huán)保綠色,操作簡(jiǎn)便的一步水熱法自組裝合成三維石墨烯-四氧化三鐵水凝膠(3D NG-Fe3O4)材料，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)形成機(jī)理進(jìn)行探討。功能化的3D NG不

8、僅保持了石墨烯固有的品質(zhì)，而且在電催化反應(yīng)和導(dǎo)電材料等方面具有相對(duì)二維（2D）石墨烯材料更優(yōu)越的性能，比如高孔隙率、高活性比表面積、柔韌性以及更優(yōu)異的導(dǎo)電性等。各種技術(shù)（SEM、TEM、EDX和 XPS）被用來(lái)表征3D NG-Fe3O4的結(jié)構(gòu)和組成，并在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下運(yùn)用3D NG-Fe3O4修飾的生物傳感器與目標(biāo)DNA雜交反應(yīng)并靈敏度分析。采用標(biāo)準(zhǔn)加樣法研究了3D NG/Fe3O4修飾的生物傳感器在白血病人血清環(huán)境中分析檢測(cè)MDR1

9、基因序列的能力，分別在TE buffer溶液，1％人血清，5%人血清中均具有良好的檢測(cè)識(shí)別能力，抗干擾性較好。
　?、?D GF/Ag NPs電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建并用于非小細(xì)胞肺癌CYFRA21-1基因RT-PCR酶切產(chǎn)物的檢測(cè)
　　采用化學(xué)氣相沉積法(CVD)，以CH4為碳源，泡沫鎳為三維模板和催化劑，制備結(jié)構(gòu)更加立體和均勻的3D石墨烯材料，利用SEM、TEM、EDX及接觸角檢測(cè)對(duì)材料的理化特性進(jìn)行表征。證明制備的3D

10、 GF是高品質(zhì)、幾乎無(wú)缺陷的。再利用電沉積法將銀納米顆粒（Ag NPs）復(fù)合到3D GF的三維立體碳骨架上，使完美的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)表面覆蓋一層具有優(yōu)異性能的Ag NPs并改善3D GF親水性。通過(guò)考察電位掃描速度與ssDNA/3D GF/AgNPs/GCE的電化學(xué)響應(yīng)的關(guān)系，探討其修飾電極表面的動(dòng)力學(xué)機(jī)理，證明了3D GF/AgNPs穩(wěn)定立體的多孔貫通結(jié)構(gòu)，不僅極大的增大電極的有效面積，也為ssDNA探針序列在電極表面的負(fù)載提供了有利條件

11、，3D GF/AgNPs是一個(gè)新穎的、有前途的電化學(xué)DNA傳感器修飾材料?；?D GF/AgNPs構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對(duì)非小細(xì)胞肺癌基因CYFRA21-1實(shí)際樣品的檢測(cè)效果滿意，證明該方法的準(zhǔn)確性。
　　⑤ DNA標(biāo)記的三明治型生物傳感器對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的檢測(cè)研究
　　制備一種三明治型免疫傳感器用于電化學(xué)測(cè)定人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的檢測(cè)，并結(jié)合電化學(xué)生物傳感器和DNA修飾抗體的優(yōu)點(diǎn)。首先用3D GF作為理想的電

12、極底層材料，再利用金納米籠功能化 MWCNT材料作為乳腺癌 ER蛋白抗體（antibody-ER，Ab1）的吸附基底。利用UV、SEM、TEM及細(xì)胞毒性測(cè)試對(duì)材料的理化特性進(jìn)行表征。Au NCs與MWCNT-NH2復(fù)合物具有低毒性、高活性比表面積、良好的生物兼容環(huán)境以及其新穎獨(dú)特籠狀結(jié)構(gòu)，能夠有效增強(qiáng)了電極表面的電子轉(zhuǎn)移能力，且與 Ab1抗體間發(fā)生高強(qiáng)度地形反應(yīng)，增加了 Ab1在電極表面的固載量,從而能夠?qū)⒏嗟娜橄侔?MCF-7細(xì)胞吸

13、附在傳感器上。利用偶聯(lián)劑EDC+NHS的作用將ssDNA的5’端修飾乳腺癌ER蛋白抗體制備ssDNA-Ab2生物探針?lè)肿?，這種方式既避免了抗體酶標(biāo)記的過(guò)程,又具有較高的捕獲效率。最后通過(guò)構(gòu)建修飾有功能化納米材料-抗體Ab1、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和ssDNA-Ab2生物探針的三明治型仿生界面成功實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的測(cè)定。該免疫傳感器也具有較好重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，同也適用于其他相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。這種構(gòu)建方式為腫瘤細(xì)胞檢測(cè)提供了一種有效的