水稻OsIPCS 家族基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析.pdf

1、肌醇磷酸神經(jīng)酰胺合酶（Inositolphosphorylceramide synthase，IPCS）能夠催化磷酸肌醇與神經(jīng)酰胺生成肌醇磷酸神經(jīng)酰胺，是植物鞘脂合成途徑中的一種關(guān)鍵酶。植物IPCS家族基因在植物的生長發(fā)育和逆境適應(yīng)中具有重要作用，有關(guān)植物IPCS家族基因的克隆、表達(dá)分析和功能的研究報道較少。水稻基因組中存在3個OsIPCS基因：OsIPCS1、OsIPCS2和OsIPCS3，到目前為止，對水稻OsIPCS家族基因的表達(dá)

2、特性和基因功能的研究報道非常有限。
　　本研究以粳稻中花11為材料，采用RT-PCR等方法克隆了3個水稻OsIPCS家族基因；通過生物信息學(xué)等方法分析了OsIPCS家族基因的序列特點、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)生樹等；基于qRT-PCR等方法對正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同組織部位的表達(dá)特性進(jìn)行了分析；利用pCXUN質(zhì)粒構(gòu)建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的過量和下調(diào)表達(dá)載體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，獲得了OsIPC

3、S2和OsIPCS3基因的過量和下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；此外，還利用煙草葉片瞬時表達(dá)法對預(yù)測的OsIPCS蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，為進(jìn)一步研究水稻OsIPCS家族基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.水稻OsIPCS家族基因的生物信息學(xué)分析
　　3個OsIPCS基因分布于第1和第5號染色體上，它們分別含有12到13個外顯子。結(jié)合擬南芥、玉米和大豆等的IPSC基因序列分析發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)植物IPCS基因都含有11個

4、內(nèi)含子，說明這可能是植物IPCS家族基因的保守特征。蛋白序列分析結(jié)果也表明，3個預(yù)測的水稻OsIPCS蛋白中均具有典型的植物IPCS家族蛋白特征，即具有高度保守結(jié)構(gòu)域D3和D4。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明大多數(shù)植物IPCS蛋白可以劃分為單子葉組和雙子葉組，OsIPCS1和OsIPCS2聚集在一個分支上而OsIPCS3位于另一分支上。
　　對3個候選的水稻OsIPCS基因的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，3個基因有幾種相同的順式作用元件如ABRE、MB

5、S、Skn-1_motif和circadian等，表明3個基因可能在植物的生長發(fā)育和外源激素以及非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。OsIPCS家族基因的啟動子序列中也有響應(yīng)生物脅迫的順式作用元件，如OsIPCS3的啟動子中有真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件Box_W1；OsIPCS1的啟動子中有防御和應(yīng)激反應(yīng)性的TC-rich repeats。
　　2.正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同組織部位的表達(dá)分析
　　熒光定量表達(dá)分析結(jié)果表

6、明，在正常生長情況下，3個候選的OsIPCS基因在水稻幼苗的根、莖、葉和孕穗期的幼穗中均有表達(dá)，說明OsIPCS基因可能在水稻生長發(fā)育過程中具有重要作用；并且3個OsIPCS基因在水稻不同組織部位中的表達(dá)量存在明顯差異，其中OsIPCS1和OsIPCS2的表達(dá)量均為幼穗>葉>根>莖，OsIPCS3則為葉>幼穗>根>莖，說明OsIPCS基因在功能上可能存在不同。在低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫下，3個OsIPCS基因的表達(dá)模式也存在明顯的差

7、異，例如低溫脅迫下，OsIPCS1和OsIPCS2在水稻幼苗的根和莖中均顯著上調(diào)表達(dá)，在葉中則下調(diào)表達(dá)；而OsIPCS3在水稻根、莖和葉中均顯著上調(diào)表達(dá)；推測OsIPCS家族基因可能在水稻的逆境適應(yīng)過程中也發(fā)揮著重要的作用，且3個OsIPCS基因可能存在功能上的分化。
　　3.水稻OsIPCS2和OsIPCS3的過量和下調(diào)表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
　　在利用RT-PCR等方法克隆了3個水稻OsIPCS家族基因的基礎(chǔ)上，利用pC

8、XUN分別構(gòu)建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的過量和下調(diào)表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化粳稻中花11，總計篩選和鑒定到了160個陽性T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株，目前已經(jīng)鑒定獲得了OsIPCS2和OsIPCS3的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因T2代種子和下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)基因T1代種子。為進(jìn)一步分析OsIPCS2和OsIPCS3基因在水稻生長發(fā)育和逆境適應(yīng)中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　4.水稻OsIPCS蛋白的亞細(xì)胞定位
　　利用WoLF PSO

9、RT在線軟件對3個OsIPCS蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明OsIPCS1在細(xì)胞溶質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)膜和液泡中均有表達(dá)，OsIPCS2在細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞溶質(zhì)_細(xì)胞核、細(xì)胞核、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中均有表達(dá)，OsIPCS3在線粒體、線粒體_葉綠體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)_線粒體中有表達(dá)。進(jìn)而，我們構(gòu)建了OsIPCS1和OsIPCS2蛋白與綠色熒光蛋白GFP的融合表達(dá)載體，煙草瞬時表達(dá)結(jié)果初步表明：OsIPCS2蛋白可能在細(xì)胞核、質(zhì)膜和其他