東太平洋熱液囪硫化物中重金屬抗性微生物及南大西洋跨洋中脊表層海水中微生物種群結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、本文通過(guò)微生物分離培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法，分析了東太平洋熱液煙囪硫化物中重金屬抗性微生物的多樣性，并對(duì)其中一株鋅抗性菌株的抗性機(jī)制進(jìn)行了初步研究;同時(shí)，詳細(xì)解析了南大西洋跨洋中脊表層海水中微生物的種群結(jié)構(gòu)。
　　第一部分:東太平洋熱液煙囪硫化物中重金屬抗性微生物的多樣性
　　重金屬污染對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康都構(gòu)成了巨大威脅，而微生物能通過(guò)多種機(jī)制對(duì)環(huán)境中的重金屬進(jìn)行吸附和去除。研究和分析深海熱液區(qū)多金屬硫化物中重金屬抗性菌的種群結(jié)

2、構(gòu)及其抗性機(jī)制，將為重金屬污染生物的修復(fù)提供參考。本研究利用七種含有不同種類重金屬(Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Hg2+、Co2+和Cr7+)的培養(yǎng)基，對(duì)兩個(gè)來(lái)自東太平洋熱液煙囪硫化物樣品進(jìn)行了富集，并獲得了抗性菌群。PCR-DGGE分析結(jié)果表明，Zn、Ni、Mn、Cu、Co和Cr抗性菌群中的優(yōu)勢(shì)類群分別是:Halomonas和Paracoccus;Microbacterium和Alcanivorax;Halomonas,M

3、arinobacter和Georgenia;Achromobacter和Serratia;Halomonas和Idiomarina;Idiomarina和Bacillus。
　　利用平板純培養(yǎng)的方法，從上述富集菌群中分離得到了多種重金屬抗性菌，包含16株細(xì)菌和8株真菌。16SrRNA基因測(cè)序結(jié)果表明，這些細(xì)菌分屬Salegentibacter,Dietzia,Paracoccus,Alcanivorax,Georgenia,Hal

4、omonas,Microbacterium，Salinicola和Thalassospira10個(gè)屬中的13個(gè)種。其中，在Zn、Ni、Mn和Co抗性菌群中，PCR-DGGE檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)種屬均獲得了純培養(yǎng)，它們分別是HalomonasMicrobacterium和Alcanivorax;Georgenia;Halomonas。另外，從Cu，Co，Zn和Ni抗性菌群中分離獲得真菌8株，ITS基因測(cè)序結(jié)果表明它們均為小紅酵母（Rhodotor

5、ulaminuta）。
　　隨后，我們對(duì)分離自Zn抗性菌群且具有較好抗性的菌株VCZn-1進(jìn)行了研究。該菌株16SrRNA基因序列與模式種HalomonaszinciduransB6T的同源性為100％。生理生化特性研究表明，該菌株最適生長(zhǎng)條件為:溫度28℃，鹽度13％和pH8～9;其對(duì)Zn2+的最高抗性為27mmol/L;原子吸收光譜測(cè)定結(jié)果表明，該菌株3天內(nèi)，能夠促使MA培養(yǎng)基中49±3.42％的Zn2+沉淀。后續(xù)Zn2+去除

6、率實(shí)驗(yàn)表明，該菌株主要的抗性機(jī)制是在穩(wěn)定期產(chǎn)生的堿性次級(jí)代謝物，使培養(yǎng)基的pH值增大，從而導(dǎo)致Zn2+的自然沉淀。此外，該菌株對(duì)其它重金屬也有較好的抗性，如Mn（9mmol/L），Cu（1mmol/L）和Ni（1mmol/L）。菌株VCZn-1基因組測(cè)序結(jié)果表明，其基因組大小約3，709，838bp，GC含量為64.04％，在其基因組中存在與重金屬抗性相關(guān)的ATPase轉(zhuǎn)運(yùn)體和RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些抗性基因的存在，可能是該菌株具有多種重

7、金屬抗性的分子基礎(chǔ)。
　　第二部分:南大西洋跨洋中脊表層海水中微生物的種群結(jié)構(gòu)分析
　　為了解析南大西洋跨洋中脊表層海水中微生物的種群結(jié)構(gòu)，本文利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)橫跨南大西洋洋中脊的14個(gè)表層海水樣品中，細(xì)菌和古菌16SrRNA基因的V5～V8區(qū)進(jìn)行了高通量測(cè)序。14個(gè)樣品共獲得177，364條序列，其中164，784條有效序列，每個(gè)樣品平均11，770條序列，序列平均長(zhǎng)度約286bp。Shannon和Chao1指

8、數(shù)均顯示，14個(gè)表層海水樣品中微生物多樣性豐富，且樣品間多樣性差別不大;Unifrac和UPGMA分析結(jié)果表明，14個(gè)樣品呈現(xiàn)按照采樣地理位置進(jìn)行聚類的趨勢(shì)，說(shuō)明它們具有一定的生物地理分布特征。同時(shí)，14個(gè)樣品在微生物組成上并無(wú)明顯區(qū)別，古菌的優(yōu)勢(shì)類群為Euryarchaeota中的MarinegroupⅡ和MarineGroupⅢ;而細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群為Alpha變形菌綱Rickettsiales目中的SAR11surfacelclade

9、(9.48％～16.19％)，以及Gamma變形菌綱Oceanospirillales目中的SAR86clade(11.93％～18.24％)。在屬水平上，14個(gè)樣品中僅有20.9％～29.1％的序列可分類到屬，其中的優(yōu)勢(shì)屬為:CandidatusPortiera,Alteromonas,Pseudoalteromonas,Fluviicola,Thalassomonas,Oleibacter,Vibrio,Hyphomonas,Alc

10、anivorax和Pelagibaca屬。
　　此外，利用富營(yíng)養(yǎng)的2216E和寡營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基，對(duì)水樣中好氧細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定。兩種培養(yǎng)基共分離獲得116株細(xì)菌，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它們分屬于Gamma-,Alpha-,Epsilonproteobacteria,Bacteroidetes,Bacilli和Actinobacteria門中的24個(gè)屬。其中Gammaproteobacteria門是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，占可培養(yǎng)菌株總數(shù)的63

11、.79％，它們歸屬于Vibrio，Pseudoalteromonas，Alteromonas，Marinobacter和Halomonas屬;Atphaproteobacteria門占24.14％，主要種屬是Erythrobacter，Pseudoruegeria和Sulfitobacter。同時(shí)，高通量測(cè)序中檢測(cè)到的Alteromonas，Alcanivorax,Marinobacter,Pelagibaca,Photobacteri