B19靶向抑制TrxR1蛋白上升ROS發(fā)揮抗胃癌活性及機制研究.pdf

1、目的：
　　B19是我們前期研究中發(fā)現(xiàn)的單羰基姜黃素類似物，對多種腫瘤細胞具有抑制活性，主要通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。但它的直接作用靶點尚不明確，它對胃癌的作用也尚無報道?；钚匝醮兀≧OS）作為化學(xué)活性分子在機體中發(fā)揮著重要的作用，過多地增加ROS的產(chǎn)生會引起細胞脂質(zhì)氧化、DNA損傷，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。TrxR1是調(diào)節(jié) ROS的重要蛋白酶，我們前期研究發(fā)現(xiàn)其在人胃癌組織中高表達。同時，前期研究還發(fā)現(xiàn)B19在胃癌細胞中能

2、夠明顯誘導(dǎo)凋亡、上調(diào)ROS水平，并伴隨著對TrxR1活性的抑制。因此，我們推測B19可能是通過靶向TrxR1來上調(diào)ROS水平，發(fā)揮抗胃癌作用。本實驗的目的就是確證TrxR1為B19的直接作用靶點，闡明B19抗胃癌的分子機制，同時為TrxR1作為胃癌治療的新靶點提供理論依據(jù)
　　方法：
　　通過表面等離子共振（SPR）實驗驗證B19與人TrxR1蛋白體外相互作用。再利用分子對接模擬技術(shù)（Molecular docking si

3、mulation）尋找TrxR1與B19的結(jié)合位點。再進一步利用DTNB還原法和胰島素終點法分別測定了B19對人TrxR1蛋白以及胃癌細胞株中TrxR1的活性抑制作用。通過流式細胞儀利用ROS探針(DCFH-DA)檢測 B19處理后人胃癌細胞株SGC-7901，BGC-823和KATO-III中的相應(yīng)ROS的水平。用MTT法、細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒檢測B19對人胃癌細胞株SGC-7901，BGC-823和KATO-III

4、的抑制活性，并驗證ROS在其中的作用。并利用Western blot和免疫熒光法檢測B19作用后胃癌細胞內(nèi)與ROS密切相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白變化。并進一步使用電鏡直接觀察B19作用后胃癌細胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變。最后用裸鼠皮下移植瘤模型驗證B19的抗胃癌活性，并進一步檢測給藥后移植瘤內(nèi)TrxR1活性以及其它相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　表面等離子共振（SPR）實驗顯示B19能夠與TrxR1發(fā)生直接相

5、互作用。分子對接模顯示B19可以和人TrxR1蛋白活性中心Cys-498側(cè)鏈形成共價結(jié)合，中間連接鏈羰基上的氧原子可以和W407側(cè)鏈形成較多的氫鍵作用。DTNB還原法和胰島素終點法實驗顯示B19可以濃度依賴性地抑制TrxR1蛋白的還原酶活性。我們利用ROS探針發(fā)現(xiàn)B19可以時間依賴地和濃度依賴地上升胃癌細胞內(nèi)的ROS水平，并且ROS清除劑（NAC）可以基本逆轉(zhuǎn)ROS的上升。MTT實驗、細胞凋亡實驗和細胞周期實驗顯示B19可以濃度依賴地抑

6、制人胃癌細胞（SGC-7901，BGC-823和KATO-III）的增殖，誘導(dǎo)G2/M阻滯和誘導(dǎo)細胞凋亡。Western Blot、免疫熒光實驗和電鏡結(jié)果顯示 B19可以時間依賴地和濃度依賴地激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（ATF4、CHOP、p-eIF2α和p-PERK）和降低細胞內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白比例，降低線粒體膜電位電勢，進一步引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹，而且ROS清除劑（NAC）可以基本逆轉(zhuǎn)上述效果。動物實驗顯示B19具有良好的抗胃癌

7、活性，而且較大劑量的B19對小鼠無明顯毒性。動物實驗更進一步發(fā)現(xiàn)B19抑制移植瘤內(nèi) TrxR1蛋白酶活性，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體紊亂信號通路相關(guān)蛋白。
　　結(jié)論：
　　TrxR1蛋白在胃癌組織中較其癌旁組織明顯高表達，可以作為治療胃癌的潛在靶點。單羰基姜黃素類似物B19通過靶向抑制TrxR1蛋白還原酶活性，上升腫瘤細胞內(nèi) ROS水平，發(fā)揮抗胃癌活性。B19上升腫瘤細胞內(nèi)ROS水平后，細胞內(nèi)過多的ROS激活下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號