RASSF7通過Coiled--coil結(jié)構(gòu)抑制Hippo信號通路促進NSCLC增殖與侵襲.pdf

1、肺癌是惡性腫瘤中導致死亡的主要原因之一，盡管近年來肺癌的治療已經(jīng)取得了較大的進步，但是由于表觀遺傳等復雜因素在腫瘤的生長和侵襲中起著重要的作用，患者長期生存率仍舊不高。因此，發(fā)現(xiàn)新的癌基因/抑癌基因并闡明其作用機制是防治腫瘤的重要任務(wù)。近年來Hippo信號通路與腫瘤的發(fā)生、進展的關(guān)系備受重視。Hippo信號通路的作用在于通過控制蛋白分布和蛋白水平來調(diào)控YAP/TAZ的功能。因此，YAP轉(zhuǎn)位入核是該通路失活的核心過程。Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族

2、(Ras-association domain family，RASSF)由十名成員組成，即經(jīng)典的RASSF1-6和N-端的RASSF7-10。前者均含C-端SARAH結(jié)構(gòu)域（Sav/RASSF/Hippo）和中間的RA結(jié)構(gòu)域，后者只有N-末端的RA結(jié)構(gòu)域，并且在其C-末端并不存在SARAH結(jié)構(gòu)域。只是最近才有人預(yù)測，在RASSF7，RASSF8和RASSF10的C-末端中可能存在另一種卷曲雙螺旋結(jié)構(gòu)(Coiled-coil domai

3、n)，而且預(yù)測它可能具備SARAH結(jié)構(gòu)域的功能。最近的研究表明:經(jīng)典的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族與Hippo通路密切相關(guān)。RA結(jié)構(gòu)域位于N-末端并缺少SARAH結(jié)構(gòu)域的非經(jīng)典的RASSF7的生物學作用和機制是否也同Hippo通路有關(guān)？這引起了我們的極大興趣。
　　目的:
　　本研究中，我們通過檢測RASSF7在非小細胞肺癌組織和肺癌細胞中的表達及與臨床病理因素、預(yù)后之間的關(guān)系，并通過體內(nèi)體外兩種實驗觀察了RASSF7的生物學功能，

4、通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多種RASSF7的突變體，旨在闡明RASSF7在非小細胞肺癌中發(fā)揮作用的可能機制。
　　方法:
　　收集88例中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療切除并具有完整隨訪資料的非小細胞肺癌患者的癌組織及20例癌旁正常組織(距癌組織5cm)石蠟包埋標本。另外收集2016年手術(shù)切除的24例新鮮肺癌組織標本。免疫組織化學檢測RASSF7在非小細胞肺癌中的表達，分析

5、其與臨床病理因素及不良預(yù)后之間的關(guān)系;Western blot和qPCR檢測肺癌組織及肺癌細胞系中RASSF7表達情況;分別在RASSF7相對表達量高或低的細胞系中敲除或過表達RASSF7，通過MTT、克隆形成實驗、基質(zhì)膠侵襲實驗和Western blot探討RASSF7對肺癌細胞增殖與侵襲及相關(guān)蛋白的影響;Western blot、熒光素酶報告基因及qPCR檢測肺癌細胞中敲除或過表達RASSF7對Hippo信號通路及下游靶基因CTGF

6、和Cyr61mRNA表達水平的影響;通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多種RASSF7的突變體，觀察RASSF7突變體對肺癌細胞的影響，并通過皮下和尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，探討RASSF7發(fā)揮作用的可能機制。
　　結(jié)果:
　　1、與癌旁正常肺組織中RASSF7低表達、幾乎為陰性表達相比，非小細胞肺癌組織中呈高表達RASSF7主要定位于胞漿。新鮮配對肺癌組織中RASSF7蛋白及mRNA的

7、表達明顯高于其配對的癌旁組織。RASSF7的胞漿高表達與肺癌患者高TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，RASSF7的胞核高表達與肺癌患者的各臨床病理因素間無明顯相關(guān)性。生存分析顯示RASSF7總表達、胞漿高表達的非小細胞肺癌患者生存時間明顯低于RASSF7胞漿陰性表達的非小細胞肺癌患者的生存時間，RASSF7胞核高表達的患者生存時間與RASSF7胞核低表達的患者生存時間相似。RASSF7胞漿高表達是非小細胞肺癌患者預(yù)后獨立危險因素。
　

8、　2、在A549和H1299細胞系中分別轉(zhuǎn)染和干擾，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒促進了細胞的增殖和侵襲（P＜0.05），提高了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表達水平，降低了P21蛋白表達水平。而轉(zhuǎn)染RASSF7-ShRNA后抑制了細胞增殖與侵襲，顯著降低了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表達，升高了P21蛋白表達水平。
　　3、轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒后可以明顯提高Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、降低核心

9、成員MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平，下游靶基因CTGF蛋白表達增多，同時，CTGF和Cyr61的mRNA表達也明顯升高;反之，敲除RASSF7時Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、核心成員MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平、游靶基因CTGF蛋白表達及CTGF和Cyr61的mRNA表達(P＜0.01)均呈現(xiàn)相反的結(jié)果。我們對轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒的細胞進行核/漿分離提蛋白，Western blot結(jié)果顯示過表達RAS

10、SF7后細胞核中的YAP蛋白表達明顯增加，敲除RASSF7降低細胞核內(nèi)YAP蛋白的表達。免疫熒光也證明了這一點。RASSF7過表達組同時敲除YAP時，上述指標表達均被恢復。
　　4、我們在證實了RASSF7能與MST1結(jié)合并且觀察到二者存在共定位的基礎(chǔ)上，用RASSF7的4種剪接體轉(zhuǎn)染A549細胞，發(fā)現(xiàn)只有去除Coiled-coil結(jié)構(gòu)域的R7-Mut4不能與MST1結(jié)合，說明二者正是通過Coiled-coil結(jié)構(gòu)域相結(jié)合來發(fā)揮作

11、用的。為了進一步驗證上述結(jié)論，我們在A549細胞中轉(zhuǎn)染RASSF7及其剪接體質(zhì)粒后，分別檢測了轉(zhuǎn)染RASSF7及其剪接體后Hippo通路核心蛋白、Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、細胞增殖及侵襲的變化。結(jié)果顯示:與RASSF7及其他三個剪接體組相比，只有R7-Mut4過表達組細胞的MST1、LATS及YAP等核心蛋白的磷酸化水平出現(xiàn)明顯回升;轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低;細胞的增殖能力下降;細胞的遷移、侵襲能力也被抑制。充分說

12、明RASSF7通過Coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MST1結(jié)合，從而通過Hippo信號通路發(fā)揮作用。而RA結(jié)構(gòu)域去除2個Coiled-coil結(jié)構(gòu)域中的1個，對RASSF7的功能影響不大。
　　5、將轉(zhuǎn)染空載體、RASSF7質(zhì)粒、RASSF7-Mut4的細胞經(jīng)皮下或尾靜脈注射裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染RASSF7-Mut4組相比，轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組的移植瘤體積和質(zhì)量均有明顯提高，其在肺內(nèi)的轉(zhuǎn)移瘤病灶數(shù)量也明顯增多。免疫組

13、織化學檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組的Ki-67蛋白的表達均顯著增加，同時YAP轉(zhuǎn)位入核增加，;而轉(zhuǎn)染R7-Mut4組無論是移植瘤的體積、質(zhì)量、Ki-67及RASSF7蛋白的表達，還是肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量及YAP核定位均較轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組有顯著下降，且接近于NC組，進一步證明了RASSF7發(fā)揮作用依賴于Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論:
　　1、RASSF7在非小細胞肺癌中高表達并與預(yù)后相關(guān);
　　2、體內(nèi)外實