克氏螯蝦殼聚糖抗菌機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的： 掌握克氏螯蝦殼聚糖的提取和鑒定的方法，檢測(cè)克氏螯蝦殼聚糖的抗菌活性，初步探討克氏螯蝦殼聚糖的抗菌機(jī)制。 方法： 1)以克氏螯蝦外殼為原料，用除鈣、脫蛋白、脫乙?；确椒ㄖ苽渚哂幸欢ǚ肿恿考懊撘阴６鹊臍ぞ厶?。 2)以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌株，用熒光試劑5(6)—羧—四甲基羅丹明-5-馬來(lái)酰亞胺對(duì)克氏螯蝦殼聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后用游離熒光試劑、標(biāo)記上熒光的殼聚糖及未標(biāo)記熒光的殼聚糖進(jìn)行抗

2、菌試驗(yàn)，觀察熒光標(biāo)記物對(duì)殼聚糖抗菌活性的影響。 3)用克氏螯蝦殼聚糖與試驗(yàn)菌作用，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)容物泄漏試驗(yàn)；用十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)進(jìn)行協(xié)同溶菌試驗(yàn)；用透射電鏡(transmissionelectronmicroscopy，TEM)觀察細(xì)菌菌體形態(tài)變化；以熒光標(biāo)記殼聚糖作為熒光標(biāo)記物，在激光共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)下觀察殼聚

3、糖在細(xì)菌的聚集部位，推導(dǎo)克氏螯蝦殼聚糖的抗菌靶位。 結(jié)果： 1)克氏螯蝦外殼含有較高含量的殼聚糖，殼聚糖的分子量與提取過(guò)程中的泡酸時(shí)間有關(guān)，脫乙酰度與乙醇鈉回流時(shí)間有關(guān)。 2)抗菌試驗(yàn)表明，相比未標(biāo)記熒光殼聚糖，熒光標(biāo)記殼聚糖的抗菌活性有所降低；當(dāng)殼聚糖與熒光物質(zhì)體積比為9：1時(shí)，殼聚糖的抗菌活性保留50％。 3)克氏螯蝦殼聚糖可導(dǎo)致菌內(nèi)物質(zhì)泄漏，并能協(xié)同十二烷基磺酸鈉發(fā)揮溶菌作用；TEM發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和殼聚糖

4、作用后，形態(tài)變得不規(guī)則、胞質(zhì)發(fā)生泄漏；LSCM發(fā)現(xiàn)，殼聚糖不僅能粘附在細(xì)菌表面，還能進(jìn)入細(xì)菌。 結(jié)論： 本研究從克氏螯蝦外殼中提取了具有一定分子量及脫乙酰度的殼聚糖；相比未標(biāo)記殼聚糖，克氏螯蝦殼聚糖與熒光物質(zhì)體積比為9：1時(shí)，既保存了50％的抗菌活性，又獲得可視熒光，可作為一種熒光標(biāo)記物用于抗菌靶位研究；克氏螯蝦殼聚糖的抗菌機(jī)制不僅包括破壞細(xì)菌表面的屏障功能，引起菌內(nèi)物質(zhì)泄漏和細(xì)菌形態(tài)變化，還包括進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部干擾其代謝。