三種近紅外熒光EMSA實(shí)驗(yàn)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、核因子-кB(NF-кB)是一種誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，參與眾多基因的表達(dá)調(diào)控，因此與許多疾病密切相關(guān)，是目前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄治療和藥物篩選的一個重要靶點(diǎn)。NF-кB結(jié)合位點(diǎn)的鑒定是發(fā)現(xiàn)其靶基因、建立其操縱的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要基礎(chǔ)。NF-кB結(jié)合位點(diǎn)的鑒定技術(shù)可分為干實(shí)驗(yàn)技術(shù)和濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)。干實(shí)驗(yàn)是基于生物信息學(xué)的鑒定技術(shù)；濕實(shí)驗(yàn)是基于生物實(shí)驗(yàn)的鑒定技術(shù)。電泳遷移率變動分析(EMSA)技術(shù)是一種低通量的濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)，數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化高通量測序技術(shù)(SEL

2、EX-Seq)是一種高通量的濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)。EMSA技術(shù)是檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的經(jīng)典濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，不僅能定性分析轉(zhuǎn)錄因子的活化水平，還能定量檢測解離常數(shù)，驗(yàn)證高通量檢測結(jié)果?，F(xiàn)有的放射性EMSA、化學(xué)發(fā)光EMSA和雙色普通熒光EMSA在實(shí)際應(yīng)用中還存在或多或少的缺點(diǎn)，限制了這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的日常應(yīng)用。近年來發(fā)展了運(yùn)用近紅外熒光素直接標(biāo)記DNA進(jìn)行EMSA檢測的近紅外熒光EMSA技術(shù)，但該技術(shù)目前使用成本非常昂貴，探針的合成及修飾費(fèi)時麻煩。因此

3、，建立一種檢測效果良好且成本低的NIRF-EMSA新方法非常必要。
　　基于此目的，本論文設(shè)計并比較了三種基于Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)的EMSA檢測方法，即：直接掃膠法、凝膠染色法和掃膜法。通過檢測分析HeLa細(xì)胞核提取物中轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的活性，發(fā)現(xiàn)掃膜法NIRF-EMSA檢測效果好、靈敏度高、性價比高，可以替代傳統(tǒng)的EMSA技術(shù)。掃膜法NIRF-EMSA的主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：蛋白與生物素標(biāo)記DNA的結(jié)合反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物的自

4、然聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠的尼龍膜電轉(zhuǎn)印、尼龍膜的近紅外熒光標(biāo)記鏈親合素檢測。該實(shí)驗(yàn)流程綜合了化學(xué)發(fā)光EMSA和近紅外熒光檢測的優(yōu)點(diǎn)，在保證檢測靈敏度的前提下，是實(shí)驗(yàn)成本降到最低，從而實(shí)現(xiàn)NIRF-EMSA的日常化低成本便利應(yīng)用。
　　本論文應(yīng)用掃膜法NIRF-EMSA技術(shù)可以分析NF-кB與不同DNA序列結(jié)合的解離常數(shù)。在掃膜法NIRF-EMSA實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)遷移帶與游離帶亮度相同時，該泳道中蛋白濃度大小與該序列的解離常數(shù)值相等。通

5、過此方法檢測了四條經(jīng)SELEX-Seq篩選得到的DNA序列的解離常數(shù)。分析各序列解離常數(shù)與SELEX-Seq富集條數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)通過掃膜法NIRF-EMSA測得的DNA序列的解離常數(shù)與富集條數(shù)之間呈負(fù)相關(guān)。證明掃膜法NIRF-EMSA可用于研究轉(zhuǎn)錄因子蛋白與DNA的相互作用。
　　基于單核苷酸突變雙鏈DNA微陣列芯片獲得的親合性數(shù)據(jù)，本論文還建立了一種單核苷酸突變矩陣(SNMM)模型，用于分析預(yù)測NF-кB與不同DNA序列的

6、結(jié)合親合性，并運(yùn)用上述NIRF-EMSA實(shí)驗(yàn)方法，共同評價和分析SELEX-Seq實(shí)驗(yàn)獲得的大量DNA序列的結(jié)合親合性，用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明DNA序列的SNMM評分值與SELEX-Seq實(shí)驗(yàn)值呈正相關(guān)。通過掃膜法NIRF-EMSA進(jìn)一步證明SNMM評分值與EMSA實(shí)驗(yàn)值吻合。將SNMM評分值高于最佳閾值的DNA序列作為轉(zhuǎn)錄因子NF-кB潛在的結(jié)合位點(diǎn)，以便進(jìn)一步從基因組中識別鑒定NF-кB靶基因。
　　基