流道網(wǎng)絡(luò)的生物3D打印及其在跨尺度血管制造中的應(yīng)用.pdf

1、生物打印，又稱細胞打印或器官打印，是組織工程領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的一種新技術(shù)。其基本原理是將細胞混合生物材料制成生物墨水，作為打印的原材料，根據(jù)器官模型數(shù)據(jù)，利用三維打印技術(shù)定向控制細胞沉積，層層累積制造成接近于真實器官結(jié)構(gòu)的活性組織器官模型。相比于傳統(tǒng)的基于支架的組織工程方法，生物打印具有可以制造出復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)、沉積不同類型細胞、構(gòu)造細胞梯度環(huán)境等優(yōu)點。由于打印后的結(jié)構(gòu)需要在體外培養(yǎng)，意味著凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞必須要能被充分灌注，以滿足生長因

2、子、氧氣以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)。因此，在打印成型的組織結(jié)構(gòu)內(nèi)構(gòu)造用于輸送營養(yǎng)的流道網(wǎng)絡(luò)是關(guān)鍵步驟，也是生物打印能否被深入應(yīng)用的一個挑戰(zhàn)。本文基于海藻酸鈉凝膠的交聯(lián)特性，利用生物打印方法中的擠出成型工藝，提出了凝膠基流道網(wǎng)絡(luò)的制造方法，并將其應(yīng)用于跨尺度血管結(jié)構(gòu)的制造。本文的主要研究內(nèi)容和成果包括:
　　(1)基于海藻酸鈉和氯化鈣“反向滴加法”的交聯(lián)方式，設(shè)計了可裝配的同軸噴頭，讓氯化鈣在海藻酸鈉的內(nèi)部與之交聯(lián)，利用同軸擠出工藝一次

3、成型出中空凝膠纖維。首先根據(jù)該方法的工藝流程搭建了同軸噴頭輔助的凝膠管道打印裝置;然后系統(tǒng)地研究了打印過程參數(shù)對凝膠管道尺寸的影響規(guī)律;并利用小分子染料、綠色熒光蛋白、牛血清蛋白對凝膠管道進行了滲透性實驗，結(jié)果表明凝膠管具有滲透性，有潛力應(yīng)用于營養(yǎng)輸送;最后直接打印小鼠成纖維細胞，細胞在凝膠管道中呈三維球形生長。
　　(2)基于海藻酸鈉和氯化鈣漸進交聯(lián)的反應(yīng)特性，提出了組織/營養(yǎng)通道同步構(gòu)造的生物打印新工藝。該方法通過控制海藻酸鈉

4、和氯化鈣的交聯(lián)時序讓相鄰的中空凝膠纖維融合，實現(xiàn)凝膠支架結(jié)構(gòu)和內(nèi)部流道網(wǎng)絡(luò)的同時成型。搭建了基于該方法的新型生物打印系統(tǒng)，通過大量的工藝實驗，解決了凝膠融合工藝，證明了融合后的凝膠結(jié)構(gòu)強度滿足器官打印的要求，后續(xù)的細胞培養(yǎng)顯示打印的營養(yǎng)通道能有效提高細胞的長期存活率。由于該方法能在打印組織結(jié)構(gòu)的同時打印出內(nèi)部的營養(yǎng)輸送通道，使得大尺寸器官3D打印成為可能。本方法還可直接應(yīng)用于器官芯片、凝膠基微流控芯片、藥物篩選芯片等領(lǐng)域。
　　(

5、3)常規(guī)血管由成纖維、平滑肌、內(nèi)皮細胞依次構(gòu)成，同時血管內(nèi)部還包含有微細的滋養(yǎng)血管用于營養(yǎng)輸送。為了對血管結(jié)構(gòu)進行仿生，提出了一種具有宏微跨尺度流道的血管結(jié)構(gòu)及其制造方法，其中宏觀流道可用于機械加載，微觀流道可用于營養(yǎng)輸送和化學加載，這種結(jié)構(gòu)可以集成到器官芯片裝置上，來更好的模擬真實血管的微環(huán)境。利用上述組織/營養(yǎng)通道同步構(gòu)造的生物打印工藝，將未完全反應(yīng)的中空凝膠纖維繞一個回轉(zhuǎn)體模板進行打印，去除模板后，中空凝膠纖維內(nèi)部的徽管道及模板的

6、宏管道構(gòu)成帶有宏微二級尺度的血管結(jié)構(gòu)。將平滑肌細胞和成纖維細胞逐層打印，并將內(nèi)皮細胞種植在所打印的血管內(nèi)壁上即可獲得跨尺度血管結(jié)構(gòu)。本方法證明了制造出的血管結(jié)構(gòu)能夠滿足后續(xù)機械加載的要求，血管結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞在培養(yǎng)一周后的活性超過90％。另外，為了演示其在組織工程領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，我們利用這種血管結(jié)構(gòu)制造了血管循環(huán)流動模型、動脈手術(shù)模擬器以及細胞共培養(yǎng)模型。
　　(4)上述方法制造出的跨尺度血管主要用于心血管疾病的致病機理的體外研究，由

7、于采用的是水凝膠材料，強度無法滿足動物實驗的長期灌注要求。為此，我們把支架制造和生物打印結(jié)合起來，提出了一種跨尺度細胞支架的制造方法。首先基于FDM的打印工藝制造出了微米尺度的支架，既保證了整個結(jié)構(gòu)的外形，又提供了強度支撐;然后利用靜電紡絲技術(shù)制造出了納米尺度的支架，營造了適合細胞生長的納米環(huán)境;接著利用生物打印技術(shù)可控定向沉積細胞，既營造了細胞的三維培養(yǎng)環(huán)境，同時利用海藻酸鈉/明膠二次交聯(lián)的方法層層組裝支架形成三維結(jié)構(gòu)。細胞培養(yǎng)實驗表