鑭系離子與八肋游仆蟲中心蛋白相互作用的電化學(xué)研究.pdf

1、中心蛋白屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族成員，在生物體內(nèi)與天然的Ca2+相結(jié)合，并且中心蛋白的許多生物功能受鈣離子調(diào)控。長久以來，本課題組一直致力于對(duì)鑭系離子和八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)的相互作用研究，利用鑭系離子豐富的光、電、磁性質(zhì)來研究鈣離子的配位微環(huán)境及成鍵情況。目前使用的研究方法主要集中在：紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。使用這些方法研究發(fā)現(xiàn)：中心蛋白可以與鑭系離子相互作用，例如與Tb3+、Lu3+、L

2、a3+。中心蛋白有4個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，可結(jié)合鑭系離子，分別是位于C端的兩個(gè)高親和的結(jié)構(gòu)和位于N端的兩個(gè)低親和結(jié)構(gòu)。鑭系離子在EoCen自組裝、與靶蛋白結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。
　　應(yīng)用電化學(xué)方法研究中心蛋白的性質(zhì)還屬于起步階段，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)將P23（截短型EoCen）加入到Eu3+溶液中時(shí)有新物種生成（即配合物P23-Eu3+）。在前期研究的基礎(chǔ)上，本文以Eu3+/Eu2+電對(duì)在電極上的氧化還原特性為基礎(chǔ)，應(yīng)用修飾

3、電極進(jìn)一步研究了N-EoCen與Eu3+的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)：配合物Eu23+-N-EoCen在 EPG、瓊脂糖、DDAB和MWNT/Nafion/GCE上都可以被還原,但是在EPG、瓊脂糖、DDAB上的氧化還原電流極小，MWNT/Nafion/GCE電極則極大地促進(jìn)了配合物在電極上的電子傳遞，其氧化還原峰電流約為EPG上的5倍。對(duì)配合物Eu23+-N-EoCen在MWNT/Nafion/GCE上的氧化還原特性的詳細(xì)研究顯示，Eu3+與

4、N-EoCen相互作用生成了2:1的配合物Eu23+-N-EoCen。配合物與電極之間發(fā)生了直接的、準(zhǔn)可逆的電子轉(zhuǎn)移。根據(jù)Laviron的非擴(kuò)散控制公式，計(jì)算得到電化學(xué)參數(shù)a，n，ks分別是0.53,2.0和1.85s-1。配合物的式電位在pH5.6～7.4范圍內(nèi)與pH呈線性關(guān)系，表明電極上兩電子的傳遞耦合有兩質(zhì)子轉(zhuǎn)移。溶液pH低于5.0時(shí)，不再符合線性關(guān)系，說明pH<5.0時(shí)，Eu3+不再與N-EoCen相互作用。這一結(jié)論也被紫外差光

5、譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在EPG電極上除了對(duì)Eu3+與N-EoCen的相互作用研究外，對(duì)Eu3+與C-EoCen的相互作用也做了相應(yīng)研究，結(jié)果顯示配合物Eu3+-C-EoCen不能在此電極上還原。
　　為了制備中心蛋白修飾電極，首先使用循環(huán)伏安（CV）和電化學(xué)阻抗（EIS）法，以鐵氰化鉀為電化學(xué)探針，詳細(xì)研究了EoCen、N-EoCen和C-EoCen在GC電極上的吸附性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)：三者的吸附過程在一定的濃度范圍內(nèi)都符合Langmuir等溫

6、式。但是三者的吸附等溫線變化趨勢不同。C-EoCen的吸附等溫線有一個(gè)平臺(tái)，而N-EoCen則出現(xiàn)了兩個(gè)吸附平臺(tái)，可能對(duì)應(yīng)著兩種吸附過程，EoCen則在達(dá)到一個(gè)平臺(tái)后隨濃度增大而迅速下降。三者不同的吸附行為可能是由于其各自的聚集性質(zhì)不同引起的。經(jīng)過計(jì)算得出的吸附自由能分別是ΔGADS（EoCen）=-50.04 kJ·mol-1;ΔGADS（N-EoCen）=-40.45 kJ·mol-1;ΔGADS’（N-EoCen）=-33.89k

7、J·mol-1;ΔGADS（C-EoCen）=41.95 kJ·mol-1。表明三種蛋白在玻碳電極表面都屬自發(fā)吸附過程，吸附能力順序?yàn)镋oCen>C-EoCen>N-EoCen。離子強(qiáng)度對(duì)中心蛋白吸附性的影響實(shí)驗(yàn)表明，提高離子強(qiáng)度，蛋白吸附能力降低，說明靜電作用在吸附過程中起關(guān)鍵作用。電極電勢對(duì)中心蛋白的吸附能力基本不影響。為了說明吸附與蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系，本文還以稀土飽和的中心蛋白、牛血清白蛋白（BSA）、CopC蛋白為模型研究了其吸附性

8、質(zhì)。結(jié)果表明稀土飽和的中心蛋白的吸附力弱于空蛋白，與中心蛋白結(jié)構(gòu)相似的富含α螺旋的BSA在GC電極上有較強(qiáng)的吸附性，與中心蛋白結(jié)構(gòu)明顯不同的富含β折疊的CopC則在GC電極上不發(fā)生吸附。說明蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)吸附性的影響較大。
　　根據(jù)中心蛋白在玻碳電極上具有的吸附性，將中心蛋白修飾在電極表面制備中心蛋白修飾電極。以鐵氰化鉀為電化學(xué)探針，使用CV和EIS法分別對(duì)修飾電極上的EoCen，C-EoCen和N-EoCen與Eu3+的相互作用進(jìn)

9、行了研究。研究表明，隨著Eu3+離子濃度的增加，探針離子的氧化還原峰電流增加，阻抗減小。從CV和EIS滴定曲線都發(fā)現(xiàn)Eu3+與EoCen形成配位比為4:1的配合物，Eu3+與N-EoCen和C-EoCen則生成2:1的配合物。對(duì)應(yīng)于EoCen蛋白四個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)了四個(gè)不同的CV和EIS響應(yīng)，說明電化學(xué)方法可以將EoCen上四個(gè)位點(diǎn)明顯區(qū)分。對(duì)不同的稀土離子與N-EoCen相互作用研究結(jié)果顯示：鑭系離子對(duì)N-EoCen的親和力順序?yàn)?/p>

10、：Gd3+≈Eu3+>La3+>>Ca2+，符合離子勢順序。本文還使用RLS法對(duì)稀土離子與中心蛋白的相互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果與電化學(xué)研究結(jié)果一致，但是RLS法不能明確區(qū)分EoCen上四個(gè)不等同的結(jié)合位點(diǎn)。為了了解本文所使用的電化學(xué)方法對(duì)其他蛋白的適用性，以BSA為模型蛋白，使用相同的方法對(duì)BSA和Eu3+的相互作用進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)鐵氰化鉀探針離子的氧化還原電流也隨Eu3+濃度的增加而增強(qiáng)。經(jīng)過計(jì)算得出Eu3+與BSA以1:1相結(jié)合，