高強度聚焦超聲輻照活體兔眼角膜后對視網(wǎng)膜及視神經(jīng)的影響.pdf

1、目的：高強度聚焦超聲（High Intensity Focused Ultrasound, HIFU）作為一種新興的體外無創(chuàng)治療技術已經(jīng)廣泛應用于婦產(chǎn)科、肝膽外科、泌尿外科等各個醫(yī)學領域，尤其是臨床實體腫瘤的治療。20世紀80-90年代的臨床實驗中發(fā)現(xiàn)，高強度聚焦超聲在眼科領域中可以用于治療青光眼疾病，然而其運用于眼科治療相關疾病是否具有安全性罕見報道。本課題組早期研究中已證實HIFU可以通過改變活體兔眼角膜的屈光狀態(tài)以矯正老視，因而本

2、研究探討高強度聚焦超聲輻照活體兔眼角膜后對視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的影響，為HIFU應用于活體角膜臨床治療的安全性提供理論支持。
　　方法：1.HIFU輻照活體兔眼角膜動物模型的構建：設置CZF型超聲治療儀治療參數(shù)為功率1w、頻率10.20MHz、脈沖1000Hz、焦距4.5mm、輻照時間6S（電動機以10r/min速度帶動超聲波治療頭勻速旋轉1周所需時間）、輻照環(huán)直徑約9mm、輻照方式以圓環(huán)狀聚焦定位輻照活體兔眼角膜基質(zhì)，制作角膜焦域環(huán)。

3、選取7只健康成年且眼部無疾患新西蘭大白兔，每只實驗兔右眼標記為實驗組，左眼標記為對照組。實驗組用HIFU以圓環(huán)狀定位輻照角膜基質(zhì)，對照組未行任何處理作為正?？瞻讓φ?。于術畢后1、7、14、30、60、90天行裂隙燈顯微鏡下觀察拍照；隨機選取5只于術前、術畢后1、7、14、30、60、90天行自動驗光儀測量術眼角膜曲率。2.HIFU輻照活體兔眼角膜后對視網(wǎng)膜的組織形態(tài)學及生物學變化觀察：41只健康新西蘭大白兔中隨機挑取36只（共72眼），

4、將分別于術畢后1、7、14、30、60、90天隨機抽取6只（12眼）處死后摘除眼球取材固定，光鏡下觀察視網(wǎng)膜細胞層數(shù)和各層細胞排列情況以及視神經(jīng)組織形態(tài)變化；透射電鏡下觀察術后視神經(jīng)細胞超微結構；并用免疫組化法檢測視網(wǎng)膜中勿動蛋白（Nogo-A）的活性表達；原位末端標記法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）檢測視網(wǎng)膜各層細胞凋亡的情況；檢測視網(wǎng)膜組織中超氧化物歧化酶（superoxid

5、e dismutase, SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。余5只作為OCT組，分別于術前、術后1、7、14、30、60、90天行光學相干斷層掃描儀(Optical Coherence Tomography, OCT)掃描觀察視網(wǎng)膜形態(tài)并測量視網(wǎng)膜厚度值。
　　結果：
　　1.成功構建HIFU輻照活體兔眼角膜動物模型。
　　2.裂隙燈觀察結果：HIFU輻照活體兔眼角膜后即刻角膜輻照范

6、圍上皮出現(xiàn)部分缺損，基質(zhì)層形成灰白色焦域環(huán)，與周邊正常組織分界清楚，熒光素鈉染色可見所對應部位著染，輻照焦域環(huán)于術后7天逐漸變淡直至消失，熒光素鈉染色為陰性，未見著染，角膜恢復透明。
　　3.自動驗光儀測量結果：HIFU輻照兔眼角膜術后1、7、14天角膜平均曲率較術前稍有增加，其中7天時增加最為顯著。術后30、60、90天角膜曲率較術前有所降低，其中術后90天角膜曲率稍有增高但曲率值未大于術前角膜曲率。
　　4.光鏡下視網(wǎng)膜

7、HE染色結果：對照組視網(wǎng)膜各層排列規(guī)律整齊，無散亂排列，視網(wǎng)膜節(jié)細胞層核清楚分明，視網(wǎng)膜各層間界線清晰厚度正常，間隔較密。輻照后各個時間節(jié)點切片HE染色光鏡下觀察結果較輻照前無明顯變化。
　　5.光鏡下視神經(jīng)HE染色結果：對照組視神經(jīng)橫切面神經(jīng)纖維排列均勻規(guī)整，基質(zhì)淡紅染，無炎性細胞浸潤，間隔均勻，血管形態(tài)完好。術后各時間點視神經(jīng)組織切片HE染色光鏡下結果較術前無明顯改變。
　　6.電鏡下視神經(jīng)超微結構觀察結果：對照組視神經(jīng)

8、纖維髓鞘完整、光滑致密，排列規(guī)整，無脫髓鞘改變。術后各時間點視神經(jīng)超微結構較術前未見明顯變化。
　　7.視網(wǎng)膜免疫組化結果：正常視網(wǎng)膜中可見神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)、外顆粒層有少量的Nogo-A陽性表達。術后各個時間點實驗組在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層和外核層均有Nogo-A表達，與正常對照組比較表達未見明顯增強。
　　8.視網(wǎng)膜細胞凋亡檢測結果：對照組及各實驗組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層（RGCS）未見陽性凋亡細胞，無細胞核皺縮或核碎裂、

9、染色質(zhì)凝集等征象。
　　9.視網(wǎng)膜組織中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量測定結果：術后1天及7天實驗組與對照組比較，實驗組SOD活力均低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同時間點，實驗組組間相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。經(jīng)統(tǒng)計分析，實驗組MDA含量均高于并接近于對照組MDA含量，同一時間點實驗組與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗組在各個時間點的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　

10、　10.視網(wǎng)膜光學相干斷層掃描結果：OCT組實驗兔結果顯示不同時間點實驗組與正常對照組的視網(wǎng)膜結構均正常，視網(wǎng)膜內(nèi)層結構清晰可見，各層結構界線分明、顯像清晰。術前視網(wǎng)膜厚度均高于術后各時點視網(wǎng)膜厚度，但經(jīng)統(tǒng)計分析后同一時間點實驗組與對照組間的數(shù)據(jù)比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）且不同時間點組間的數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論：
　　1.適當劑量的HIFU可準確定位于角膜基質(zhì)層，對輻照區(qū)外正常角膜組