全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、全程自養(yǎng)脫氮，即Deammonification，是一種新型的污水脫氮工藝。它是指在同一反應(yīng)器中，在限氧和較高pH值條件下，完全由自養(yǎng)菌群作用將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)舛サ默F(xiàn)象。它于90年代后期被發(fā)現(xiàn)，主要存在于生物轉(zhuǎn)盤、生物濾池和生物流化床等生物膜系統(tǒng)中。近幾年來，國(guó)外的許多研究機(jī)構(gòu)開始了對(duì)全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的研究。本研究也是污水脫氮領(lǐng)域的前沿課題之一。 本論文建立了全程自養(yǎng)脫氮的完全混合活性污泥反應(yīng)器和懸浮填

2、料反應(yīng)器2個(gè)系統(tǒng)，以市政污水處理廠二沉池活性污泥進(jìn)行接種，通過3個(gè)月至半年的馴化，并精確控制反應(yīng)條件，在實(shí)驗(yàn)室成功富集了具有較高全程自養(yǎng)脫氮效率的污泥微生物樣本。這是首次對(duì)連續(xù)運(yùn)行的活性污泥反應(yīng)器中的全程自養(yǎng)脫氮現(xiàn)象進(jìn)行研究。 在此基礎(chǔ)上，本論文綜合使用多種分子生物學(xué)手段，主要是16SrRNA同源性分析方法、分子克隆文庫(kù)構(gòu)建和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，分析全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中的微生物群落組成，對(duì)參與全程自養(yǎng)脫氮的關(guān)鍵細(xì)菌進(jìn)行系

3、統(tǒng)發(fā)育分析，觀察全混污泥和懸浮填料2個(gè)反應(yīng)器在不同操作條件和不同處理效果時(shí)的菌群動(dòng)態(tài)變化，揭示系統(tǒng)中微生物群落的空間結(jié)構(gòu)和相互作用關(guān)系，探索以分子手段對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的可行性，全面闡述全程自養(yǎng)脫氮反應(yīng)的微生物學(xué)機(jī)制，并基于雙層膜結(jié)構(gòu)理論，提出了關(guān)于全混合活性污泥模式不可持續(xù)的原因的假說。 本論文建立的全混合活性污泥反應(yīng)器，從馴化開始大約80天后，總氮去除率可達(dá)62﹪，系統(tǒng)的容積去除率達(dá)到85mgN/(Ld)，然而，在

4、大約100天后，系統(tǒng)的脫氮效率明顯下降，直至最終脫氮效果幾乎全面喪失。批式試驗(yàn)證明：80天時(shí)的污泥生物相可以在限制溶氧條件下，將NH4+-N氧化成NO2--N，同時(shí)又可催化NH4+-N和NO2--N反應(yīng)生成N2，整個(gè)脫氮過程不需外加有機(jī)碳源，符合全程自養(yǎng)脫氮的全部條件。而懸浮填料反應(yīng)器在經(jīng)過4-5周的試運(yùn)行完成掛膜后，總氮去除率為70﹪±5﹪，容積去除效率為95±12mgN/(Ld)，在近300天的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，該反應(yīng)器均保持相當(dāng)好的脫氮效

5、果。 為了摸索出最有效的DNA提取方法，本文分別采用酶法、化學(xué)法、珠磨勻漿法和反復(fù)凍融法對(duì)活性污泥樣品進(jìn)行破壁，提取總DNA，并通過提取的核酸總量、純度、片段分布情況、是否含有PCR反應(yīng)酶抑制劑、以及ITS擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性共5個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)不同的細(xì)胞破壁方法對(duì)活性污泥總DNA提取效果的影響。結(jié)果表明：化學(xué)法的優(yōu)勢(shì)最明顯，結(jié)果最穩(wěn)定。提取的總量最多，片段長(zhǎng)度也大，但是雜質(zhì)含量也較大，純度較低，不過這些雜質(zhì)并不影響PCR反應(yīng)。ITS擴(kuò)增

6、產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性分析也證明化學(xué)法的偏倚性最小。因此，本文在以后的研究中采用化學(xué)法提取總DNA。 本文在全混污泥反應(yīng)器和懸浮填料反應(yīng)器運(yùn)行的不同階段取樣，使用真細(xì)菌通用引物926f和1545r對(duì)污泥總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆文庫(kù)的分析結(jié)果顯示：在活性污泥系統(tǒng)逐步惡化的過程中，其中的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了巨大變化，類浮霉?fàn)罹鷮偌?xì)菌Planctomycetes從占據(jù)優(yōu)勢(shì)到完全消失，而氨氧化菌克隆從只占文庫(kù)的2.4﹪上升到占70﹪。這一過程還

7、伴隨著大量異養(yǎng)細(xì)菌的消亡。在懸浮填料系統(tǒng)中，類Planctomycete細(xì)菌、Nitrosomonas屬氨氧化菌、和另外一些功能未知的、能在貧營(yíng)養(yǎng)條件下生存的紫細(xì)菌構(gòu)成了其中穩(wěn)定的生物相。這一結(jié)果表明：類浮霉?fàn)罹鷮貾lanctomycete細(xì)菌是全程自養(yǎng)脫氮過程的關(guān)鍵種群，它的消失是反應(yīng)器脫氮效率降低的直接原因。類Planctomycete細(xì)菌和Nitrosomonas屬氨氧化菌是全程自養(yǎng)脫氮生物相中最重要的2個(gè)成員。本實(shí)驗(yàn)室的全混污泥

8、反應(yīng)器和懸浮填料反應(yīng)器中的類Planctomycete菌克隆彼此親緣關(guān)系較近，但與已知的Anammox細(xì)菌CandidatusBrocadiaanammoxidans和CandidatusKueneniaStuttgartiensis的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這說明：能夠完成自養(yǎng)脫氮的浮霉?fàn)罹诜N的水平上可能是很豐富的。本文還發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器運(yùn)行不同階段的氨氧化菌都屬于Nitrosomonas屬，但其中的優(yōu)勢(shì)種并不相同。 為了了解不同目標(biāo)基因?qū)?/p>

9、氨氧化菌種群分析結(jié)果的影響，理解多種手段的重復(fù)交叉驗(yàn)證對(duì)于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要意義，本文針對(duì)3類目標(biāo)基因，16SrDNA上的氨氧化菌特異的CTO片段、氨單加氧酶活性基因amoA片段和16S-23SrRNA基因間隔序列ITS片段，建立克隆文庫(kù)或通過電泳分離，考察不同污泥樣品中的氨氧化菌組成和種群內(nèi)變遷。結(jié)果表明：隨著馴化的進(jìn)行，Nitrosospira屬細(xì)菌和Nitrosomonasoligotropha細(xì)菌逐漸被能夠耐受高氨氮低溶氧的Nitr

10、osomonaseuropaea細(xì)菌所代替。而氨氧化菌的種群變遷可能并不是全混流系統(tǒng)全程自養(yǎng)脫氮效率下降的原因。在方法學(xué)方面，本文發(fā)現(xiàn)：基于CTO片段和氨單加氧酶活性基因amoA片段的研究結(jié)果吻合良好。 FISH試驗(yàn)表明：在全程自養(yǎng)脫氮反應(yīng)器中，存在一種在可見光下呈紅色的菌落。這一菌落能夠與類Planctomycete細(xì)菌的16SrRNA探針雜交。在活性污泥系統(tǒng)中，雜交區(qū)域位于一個(gè)大菌落中心，被大量異養(yǎng)細(xì)菌緊密包圍。氨氧化菌探針

11、的雜交實(shí)驗(yàn)顯示：氨氧化菌點(diǎn)綴于菌群中，沒有聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì)。這一結(jié)果充分肯定了在全混污泥系統(tǒng)中，異養(yǎng)細(xì)菌的作用——維持共生體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為關(guān)鍵細(xì)菌類Planctomycete創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)代謝環(huán)境——無氧的自養(yǎng)的微生境。而生物膜系統(tǒng)能夠較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定運(yùn)行，是由于有微生物共生體所需要支持性載體存在。 本文還以全程自養(yǎng)脫氮類浮霉?fàn)罹奶卣餍蛄?、ITS擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性和隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性為分子標(biāo)記，進(jìn)行了反應(yīng)器分子監(jiān)測(cè)的試驗(yàn)?？疾焓?/p>

12、政污水處理廠活性污泥、全程自養(yǎng)脫氮反應(yīng)器污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群演變情況，以及污泥生物多樣性變化情況。以類浮霉?fàn)罹奶卣餍蛄袨榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的引物在市政污水處理廠污泥和反應(yīng)器污泥中都擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆文庫(kù)表明：這對(duì)引物能夠擴(kuò)增出2種類浮霉?fàn)罴?xì)菌，其中一種經(jīng)馴化篩選后，成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌群。這意味著全程自養(yǎng)脫氮反應(yīng)很可能是浮霉?fàn)罹鷮僦械囊恍┚N在特定條件下形成的一種特殊的代謝途經(jīng)。 本文進(jìn)行了以ITS擴(kuò)增多態(tài)性和隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性