rhizobiumsp.th菌降解微囊藻毒素的機(jī)理及mlra基因的進(jìn)化來源

1、 分類號(hào) 密 級(jí) UDC 學(xué)校代碼 10497 學(xué) 位 論 文 題目 Rhizobium sp.TH 菌降解微囊藻毒素的機(jī)理及 mlrA 基因的進(jìn)化來源 英文 Biodegradation mechanism of microcystin-LR by Rhizobium sp. 題目 TH and the evo

2、lutionary origin of the mlrA gene 研究生姓名 祝 曉 蕓 姓名 陳曉國 職稱 教授 學(xué)位 博 士 單位名稱 資源與環(huán)境工程學(xué)院 郵編 430070 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別 工學(xué)碩士 學(xué)科專業(yè)名稱 環(huán)境科學(xué)與工程 論文提交日期 2016 年 4 月

3、 論文答辯日期 2016 年 5 月 學(xué)位授予單位 武漢理工大學(xué) 學(xué)位授予日期 2016 年 6 月 答辯委員會(huì)主席 張高科 評(píng) 閱 人 肖邦定 黃 敏 2016 年 05 月 指導(dǎo)教師 I 中文摘要 微生物降解是微囊藻毒素（MCs）在環(huán)境中歸趨的主要途徑，研究 MCs 的微生物降解過程和機(jī)理對(duì)認(rèn)識(shí) MCs 在環(huán)境中的歸趨具有重要意義。目前已從環(huán)境中分離

4、出 60 余株 MCs 降解菌，它們主要集中于 α-變形菌綱的鞘氨醇單胞菌目，且多具有 mlrA 基因，說明這些菌可能通過 mlr 途徑降解 MCs。由于缺少mlr 基因序列信息，尤其是來自非鞘氨醇單胞菌目的 α-變形菌的 mlr 基因信息，使得對(duì) mlr 基因的進(jìn)化來源及其在降解菌中的分布仍缺乏認(rèn)識(shí)。 此前， 本實(shí)驗(yàn)室從太湖沉積物中分離出一株 MCs 降解菌 Rhizobium sp. TH， 該菌是首株屬于非鞘氨醇單胞菌目的 α-變

5、形菌綱的 MCs 降解菌。 盡管在 TH 菌中未能檢測(cè)到 mlrA 基因，但是檢測(cè)到了 mlrB、mlrC 和 mlrD 基因，說明該菌可能通過 mlr 途徑降解MCs。該降解菌的分離為研究 mlrA 基因的進(jìn)化來源及分布提供了理想材料。 本研究首先利用新設(shè)計(jì)的引物對(duì) TH 菌的 mlrA 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)， 然后通過普通 PCR 和步移 PCR 擴(kuò)增 mlr 基因簇基因間序列及其兩端未知序列， 測(cè)序拼接獲得 TH 菌的 ml

6、r 基因簇全序列，并在此基礎(chǔ)上對(duì) mlr 基因簇中的基因進(jìn)行了序列分析及異源表達(dá)驗(yàn)證，確認(rèn)了 TH 降解 MCs 的機(jī)理。通過對(duì)已有 MCs降解菌 mlrA 基因及 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹的比較， 對(duì) mlrA 基因的進(jìn)化來源及其在降解菌中的分布進(jìn)行研究。具體的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： （1）根據(jù)已報(bào)道的 mlrA 基因序列設(shè)計(jì)引物 mlrAtf/mlrAtr，利用該引物成功檢測(cè)到 TH 菌 mlrA 基因。比對(duì)結(jié)果表明，引物 mlr

7、Atf/mlrAtr 與來自不同屬 MCs降解菌的 mlrA 基因均高度匹配，說明該引物具有廣泛的適用性，可用于對(duì)環(huán)境中的 mlrA 基因進(jìn)行檢測(cè)，以便對(duì) MCs 污染進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 （2）通過普通 PCR 對(duì) TH 菌 mlr 基因簇基因間序列進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后拼接得到 mlr 基因簇部分序列，然后利用步移 PCR 對(duì) mlr 基因簇兩端未知序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，最終獲得全長(zhǎng)為 6673 bp 的 TH 菌 mlr 基因簇全序列。該基因

8、簇中依次含有 mlrC、mlrA、mlrD 和 mlrB 4 個(gè)基因，其中 mlrA 和 mlrD 基因與 mlrB 和mlrC 基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。 （3） 通過對(duì)降解基因及其蛋白的功能和結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)可知， TH 菌 MlrA 酶含有 H260AIH263NE265 基序，推測(cè)該基序可能為該酶的活性中心。MlrA 和 MlrD 酶均含有跨膜區(qū)，且 MlrA 酶還具有信號(hào)肽序列，而 MlrB 和 MlrC 酶均不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)。MlrB