環(huán)境中微量氯苯酚類環(huán)境激素的免疫分析方法研究.pdf

1、近幾十年來，隨著環(huán)境激素類人工合成化學品和藥品使用的日益增多，對人和動物體的生理活性造成了很大的影響。環(huán)境激素是環(huán)境中的激素類似物，它能通過與激素受體結(jié)合，干擾生物體正常的生理代謝、內(nèi)分泌和生殖機能，直接影響生物多樣性，危及生物安全，對人類未來構(gòu)成潛在威脅。環(huán)境激素污染問題已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問題，成為環(huán)境科學研究領域中的熱門課題。
　　 本課題利用免疫分析方法具有快速靈敏、操作簡便、經(jīng)濟適用等方面的

2、特點，將其運用于環(huán)境中微量的環(huán)境激素的檢測中，填補了傳統(tǒng)色譜分析中的分析時間長、前處理繁瑣及儀器昂貴的不足。當前，免疫分析技術應用于小分子物質(zhì)的檢測日益受到重視，已經(jīng)成為監(jiān)測分析環(huán)境中痕量污染物研究的熱點，若將其與傳統(tǒng)分析技術聯(lián)用，相互借鑒相互補充，必然會有一個更為廣闊的應用前景。
　　 本課題為探討有關環(huán)境激素的免疫化學特性，選擇具有代表性的酚類環(huán)境激素中的三種氯苯酚：2,4-二氯苯酚(DCP)、2,4,6-三氯苯酚(TCP)

3、和五氯苯酚(PCP)作為研究對象。將不具免疫原性小分子氯苯酚進行修飾改造合成半抗原，并與蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成具有免疫原性的人工抗原，免疫動物產(chǎn)生抗體，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合反應，分別建立了三種氯苯酚類環(huán)境激素的免疫分析新方法，為環(huán)境激素的研究提供更加快速靈敏、簡便經(jīng)濟的監(jiān)測分析手段，為探索小分子化合物免疫分析技術的一些基本規(guī)律，研究和開發(fā)快速靈敏的痕量環(huán)境激素的檢測新技術奠定基礎。本課題主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴對2,4-二氯苯酚

4、、2,4,6-三氯苯酚和五氯苯酚結(jié)構(gòu)進行修飾，通過重氮法在2,4-二氯苯酚分子中引入羧基基團合成了DCP半抗原；通過氯乙酸法在2,4,6-三氯苯酚和五氯苯酚分子中引入羧基基團分別合成了TCP和PCP半抗原。采用活化酯法或混合酸酐法使氯苯酚半抗原分別與牛血清白蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)，合成了氯苯酚-BSA免疫原和氯苯酚-OVA包被原。對各偶聯(lián)物進行紫外光譜掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，并計算出半抗原與蛋白質(zhì)結(jié)合比在7～29：1之間，符合小

5、分子免疫學的要求。
　　 ⑵將免疫原與適當?shù)淖魟┤榛螅庖咝挛魈m大白兔制備了三種氯苯酚的多克隆抗體。以試管凝集試驗、瓊脂雙向擴散實驗和間接ELISA法鑒定了各個抗體的效價，其中，ELISA法測定抗DCP血清效價在3.2×104～1.28×105之間；抗TCP血清效價在1.6×104～1.28×105之間;抗PCP血清效價在6.4×104～1.28×105之間。用辛酸-硫酸銨二步沉淀法、葡聚糖凝膠除鹽及DEAE-纖維柱精制提純?nèi)?/p>

6、種氯苯酚的抗血清，得到純化的三種氯代苯酚抗體IgG，4(℃)或凍干于-20(℃)保存。
　　 ⑶利用透析法制備的2,4-二氯苯酚的FITC熒光素標記抗體和抗DCP抗體，在優(yōu)化條件下分別建立了2,4-二氯苯酚間接ELISA法、間接FIA法和直接FIA法。間接ELISA法的線性范圍為2～100μg/L，線性方程為I=20.21logC+24.13，相關系數(shù)r=0.9917，檢出限為0.63μg/L；間接FIA法的線性范圍為1～100

7、μg/L，線性方程為F=22.22logC+28.59，相關系數(shù)r=0.9898，檢出限為0.41μg/L；直接FIA法的線性范圍為1～100μg/L,，線性方程為F=21.57logC+26.83，相關系數(shù)r=0.9926，檢出限為0.4μg/L。其它氯苯酚類似物的交叉反應率均小于5％，由此說明所得的抗體對2,4-二氯苯酚有很強的特異性。比較可知，F(xiàn)IA法比ELISA法具有更寬的線性范圍及更低的靈敏度。采用間接FIA法分別檢測環(huán)境樣品

8、中2,4-二氯苯酚的含量，回收率在86.6～119.5％之間；變異系數(shù)CV在2.87～6.53％之間。采用直接FIA法分別檢測環(huán)境樣品中2,4-二氯苯酚的含量，回收率在84.6～114.7％之間；變異系數(shù)CV在1.73～7.46％之間。結(jié)果表明FIA法能滿足環(huán)境樣品中微量2,4-二氯苯酚的檢測要求。
　　 ⑷采用攪拌法制備了2,4,6-三氯苯酚的FITC熒光素標記抗體，瓊脂雙向擴散法鑒定標記抗體效價為1：16，間接FIA法鑒定標

9、記抗體效價為6.4×104，抗體結(jié)合比率為3.4，符合實驗要求。使用自制的FITC標記抗體和抗TCP抗體，在優(yōu)化條件下分別建立了2,4,6-三氯苯酚直接FIA法和間接FIA法。直接FIA法的線性范圍為1～100μg/L，線性方程為F=27.61logC+19.65，相關系數(shù)r=0.9938，檢出限為1.02μg/L；間接FIA法的線性范圍為0.5～100μg/L，線性方程為F=21.91logC+36.32，相關系數(shù)r=0.9936，檢

10、出限為0.18μg/L，除了對半抗原的交叉反應率較大外，其它氯苯酚類似物的交叉反應率均小于4％，由此說明所得的抗體對2,4,6-三氯苯酚有很強的特異性。采用直接FIA法分別檢測環(huán)境樣品中2,4,6-三氯苯酚的含量，回收率在84.5～110.8％之間；變異系數(shù)CV在2.05～7.94％之間。采用間接FIA法分別檢測環(huán)境樣品中2,4,6-三氯苯酚的含量，回收率在85～119％之間；變異系數(shù)CV在1.92～9.64％之間。結(jié)果表明FIA法能滿

11、足環(huán)境樣品中微量2,4,6-三氯苯酚的檢測要求。
　　 ⑸利用制備的抗PCP抗體，在優(yōu)化條件下建立了五氯苯酚間接FIA法。間接FIA法的線性范圍為0.5～5μg/L，線性方程：F=4.15logC+33.03，相關系數(shù)r=0.9926，檢出限為0.29μg/L，除了對半抗原的交叉反應率較大外，其它氯苯酚類似物的交叉反應率均小于6％，由此說明所得的抗體對五氯苯酚有很強的特異性。并在五氯苯酚間接FIA法的研究基礎上，初步研制了一套五