e.colif18敏感型和抵抗型斷奶仔豬十二指腸差異mirnas的篩選及驗(yàn)證分析

1、E c o l iF 1 8 敏感型和抵抗型斷奶仔豬十二指腸差異m i R N A s的篩選及驗(yàn)證分析轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)( 2 0 0 9 Z X 0 8 0 0 6 —0 0 4 B )N a t i o n a lM a j o r T e c h n o l o g y P r o j e c t so f G e n e t i c a l l yM o d i f i e d O r g a n i s m sB

2、 r e e d i n g ( 2 0 0 9 Z X 0 8 0 0 6 —0 0 4 B )國家自然科學(xué)基金( 3 11 7 2 1 8 3 ，3 11 4 0 0 2 7 )N a t i o n a l N a t u r a lS c i e n c eF u n d s( 3 11 7 2 1 8 3 ，3 1 1 4 0 0 2 7 )揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2 0 1 1 年5 月?lián)P州大學(xué)碩士學(xué)位論文m i R N A 有1

3、4 條，前體序列位于基因序列間的m i R N A 有4 5 條。構(gòu)建差異m i R N A 前體與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合網(wǎng)絡(luò)——T F ．G e n e ．N e t w o r k ，網(wǎng)絡(luò)中單一m i R N A 前體最多受到了3 個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，均為上調(diào)表達(dá)的差異m i R N A 。對差異m i R N A 靶基因與表達(dá)譜差異基因交集基因G o o n t o l o g y 分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建( m i R - G O - N e t w

4、 o r k ) ，這些差異表達(dá)的m i R N A 對應(yīng)靶基因主要涉及細(xì)胞黏附( c e l la d h e s i o n ) 、轉(zhuǎn)錄調(diào)控( p o s i t i v e r e g u l a t i o no f t r a n s c r i p t i o n ) 、細(xì)胞凋亡的調(diào)控( p o s i t i v e r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s ) 以及對脂多糖的應(yīng)答

5、( r e s p o n s e t ol i p o p o l y s a c c h a r i d e ) 等多個方面。3 ．結(jié)合可能與Ec o l iF 1 8 感染相關(guān)的生物學(xué)功能，對所有上下調(diào)差異m i R N A 對應(yīng)靶基因的顯著性功能分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步篩選，得到5 3 個顯著性G O ，與差異m i R N A 構(gòu)建m i R N A —G O - N e t w o r k ，篩選出在兩組樣本中關(guān)鍵的差異m i R

6、 N A 以及這些m i R N A 所調(diào)控的靶基因的主要功能。同時，利用圖論的方法對網(wǎng)絡(luò)中的差異m i R N A 和G O 在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控地位進(jìn)行評價，得到關(guān)鍵的差異m i R N A 和G O 。分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)的m i R N A對應(yīng)靶基因主要參與了免疫應(yīng)答的各種通路。利用m i R N A 與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建m i R N A ．G e n e ．N e t w o r k ，同時，利用圖論的方法對網(wǎng)絡(luò)中m

7、 i R N A 在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控地位進(jìn)行評價，結(jié)合E c o l iF 1 8 的致病機(jī)制以及個體感染后引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時參考前期與豬相關(guān)的m i R N A 研究報(bào)道，獲得1 2 個關(guān)鍵差異m i R N A ，包括1 1 個上調(diào)的差異m i R N A ，包括S S C —m i r 一1 4 3 、S S C —l e t ．7 f 、S S C ．m i r ．3 0 e 、S S C ．m i r - 1 4 8 a 、

8、S S C ．m i r ．1 4 8 b 、S S C ．m i r —1 8 1 a 、S S C ．m i r ．1 9 2 、S S C ．m i r ．2 7 b 、S S C ．m i r - 1 5 b 、S S C ．m i r 一2 1 、S S C ．m i r - 2 1 5 ，和1 個下調(diào)的差異m i R N A ：S S C —m i r - 15 2 。4 ．由于S S C —m i r ．3 0 e 、S

9、S C —m i r 一1 4 8 b 和S S C ．m i r - 1 8 1 a 沒有對應(yīng)的商業(yè)化T a q M a nm i R N AA s s a y s 定量試劑盒，對剩余9 個目標(biāo)m i R N A 在擴(kuò)大樣本量的E c o l iF 1 8 敏感組和抗性組間進(jìn)行了熒光定量驗(yàn)證，定量結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致。m i R ．2 1 5 和m i R ．1 9 2 在敏感組和抗性組之間差異極顯著( p < 0 ．0 1

10、 ) 。另外，m i R 一1 5 b 、m i R ．1 5 2 、m i R ．1 4 3 ．5 p 和l e t ．7 f 在敏感組和抗性組之間的表達(dá)顯著差異( p < O ．0 5 ) 。5 ．通過表達(dá)譜芯片與小R N A 芯片數(shù)據(jù)聯(lián)配獲得顯著差異表達(dá)( p < 0 ．0 5 ) 的m i R N A 和m R N A ，篩選的m i r - 2 1 5 對應(yīng)的靶基因A L C A M 、D L G 5 、F R M

11、 D 4 B 、M I P O L l 、Z F H X 3 以及m i M 5 b 、l e t ．7 f 對應(yīng)的共同靶基因E G L N 2 、C D C l 4 B 、M A P 4 K 3 、A B L 2 、P R K A B 2 ，通過種子序列驗(yàn)證m i R N A 和m R N A 的對應(yīng)關(guān)系，G O 和K E G G 通路分析得知，這些基因共同參與細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架作用、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和M A P K 信號通路過程中。關(guān)