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1、中圖分類號(hào)U D C7 7 ，6 1 0博士學(xué)位論文學(xué)校代碼密級(jí)1 0 5 3 3公玨A t o h 7 調(diào)控視網(wǎng)膜M u l I e r 細(xì)胞向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞定向分化的機(jī)制研究A t o h 7 p r o m O t e s t h em e c h a n i s m o f d i f f e r e n t i a t i o n o fM i i l l e rc e l l si n t or e t i n a l g a

2、n g l i o n c e I l s作者姓名： 宋偉濤學(xué)科專業(yè)： 臨床醫(yī)學(xué)研究方向： 眼科學(xué)學(xué)院( 系、所) ：湘雅醫(yī)院指導(dǎo)教師： 夏曉波教授論文答辯日期嬰! 生』．；】 答辯委員會(huì)主席 碰》中 南大學(xué)二。一四年五月博士學(xué)位論文 中文摘要中文摘要第一章視網(wǎng)膜M i i l l e r 細(xì)胞的純化培養(yǎng)及去分化誘導(dǎo)目的：分離和純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞及去分化誘導(dǎo)并鑒定。方法：取出生1 0 ．2 1 天S D 大鼠，顯

3、微鏡下分離視網(wǎng)膜，采用反復(fù)不完全胰酶消化法傳代培養(yǎng)。取第三代視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞行熒光激活流式細(xì)胞分選儀( F A C S ) 、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色及R T ．P C R檢測(cè)，確定視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞的純度。取第三代視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞，在去分化培養(yǎng)基( 含l ×N 2 ，2 ×B 2 7 ，2 0 n g ／m l E G F ，1 0 n g ／m 1 b F G F

4、)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)去分化。顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、R T ．P C R 、W e s t e m - b l o t 檢測(cè)視網(wǎng)膜干細(xì)胞特異性標(biāo)記物K i ．6 7和N e s t i n 的表達(dá)；E d u 染色檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：F A C S 檢測(cè)視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞的純度高達(dá)9 8 ．0 1 ％。熒光顯微鏡1 0 倍下選取1 0 個(gè)非重疊視野，計(jì)算表達(dá)G S 的細(xì)胞陽性率，G S 的細(xì)胞陽性表達(dá)

5、率為9 8 ．5 0 ％士1 ．0 8 ％。R T ．P C R 結(jié)果顯示純化后的細(xì)胞高表達(dá)視網(wǎng)膜M t l l l e r 細(xì)胞特異性標(biāo)記物( G S 、V i m e n t i n ) ，而視網(wǎng)膜中其他類型細(xì)胞的標(biāo)記物無表達(dá)。去分化培養(yǎng)3 —7 天，細(xì)胞增殖聚集成球。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)顯示，神經(jīng)球N e s t i n 的陽性率為9 2 ．9 4 ％士6 ．4 8 ％， K i ．6 7 的陽性率 8 5 ．9 6 ％士6 ．0 4

6、 ％；R T ．P C R 及W e s t e m ．b l o t 顯示，神經(jīng)球高表達(dá)K i ．6 7 和N e s t i n 的m R N A 及蛋白產(chǎn)物。E d u 染色顯示神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞核陽性率為8 2 ．8 0 士6 ．6 5 ％，表明細(xì)胞具有活躍的增殖能力。結(jié)論：采用反復(fù)不完全胰酶消化傳代法可快速、高效獲得高純度的鼠視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞。純化的視網(wǎng)膜M n l l e r 細(xì)胞在去分化培養(yǎng)培養(yǎng)基中克隆增殖形成