亞甲基藍熒光探針對DNA的分析及其在重金屬和百草枯與DNA作用研究中的應用.pdf

1、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質(zhì)基礎，在生物體的繁育、遺傳和變異等生命過程中起著極為重要的作用。環(huán)境中大量有毒有害物質(zhì)如重金屬、有機染料、農(nóng)藥等可通過飲食、呼吸、皮膚接觸等途徑進入機體，在體內(nèi)與DNA發(fā)生直接或間接的作用，改變DNA結(jié)構(gòu)與構(gòu)象或引起DNA損傷，從而影響其功能或改變其遺傳特性。鑒于DNA重要的生理意義，本論文建立了靈敏測定DNA的亞甲基藍同步熒光猝滅法，并

2、以亞甲基藍為分子探針，研究了重金屬和百草枯與小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。論文主要內(nèi)容包括以下四個部分： 第一部分：基于DNA對有機染料亞甲基藍(MB)的熒光猝滅效應，結(jié)合同步熒光技術(shù)建立了一種靈敏測定DNA的同步熒光猝滅法。在pH=6.5～8.2范圍內(nèi)，DNA對亞甲基藍在680 nm處的熒光猝滅程度與DNA的濃度呈線性關(guān)系，對于測定ctDNA、變性ctDNA和鯡魚精DNA(hsDNA)，線性范圍分別為0.1～4.0μ

3、gmL-1、0.05～3.0 μg·mL-1和0.1～3.0 μg·mL-1，檢測限(S/N=3)分別為41.1、13.2和14.5 ng·mL-1。該方法簡便快速、試劑毒性較小，用于合成樣品中DNA的測定，結(jié)果令人滿意。 第二部分：應用吸收光譜、熒光光譜和熒光偏振研究了MB與ctDNA的作用方式。當γ＜4(γ=[DNA(P)]/[MB])時，MB的吸收隨ctDNA濃度的增加呈明顯的減色效應，其熒光被ctDNA明顯猝滅

4、；而當γ＞6時MB的吸收帶發(fā)生紅移，其熒光偏振明顯增大，上述結(jié)果表明MB與ctDNA可能存在兩類結(jié)合，γ較低時(γ＜4)，MB陽離子易與ctDNA鏈上帶負電荷的磷酸基團以靜電相吸的方式結(jié)合而堆積在ctDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)表面；而當γ較高時(γ＞6)，MB分子與ctDNA堿基間通過π-π相互作用及疏水相互作用而發(fā)生嵌插結(jié)合。熱變性和K4Fe(CN)6熒光猝滅研究表明，MB與ctDNA之間的作用方式隨二者濃度比的變化而不同，與吸收光譜和熒光光譜

5、的結(jié)果一致。實驗獲得了靜電結(jié)合和嵌插結(jié)合這兩類結(jié)合的鍵合常數(shù)K，分別為2.94×105L·mol-1和1.13×106L·mol-1。 第三部分：以MB為分子探針，用吸收光譜和熒光光譜研究了Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Cr(Ⅲ)三種重金屬離子與ctDNA的相互作用。MB分子通過嵌插方式結(jié)合到ctDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上，其熒光被ctDNA明顯猝滅，其吸收光譜呈現(xiàn)減色效應；而三種重金屬離子的加入不同程度地增強MB-ctDNA體系的熒光，同時

6、體系的吸收光譜產(chǎn)生增色效應。結(jié)果表明Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Cr(Ⅲ)離子可能與ctDNA鏈上磷酸基團的氧原子或嘌呤堿基N-7配位，取代了嵌入在ctDNA雙螺旋中的MB分子，使其游離出來，導致體系的熒光光譜和吸收光譜呈現(xiàn)出MB自身的光譜特征。實驗獲得三種重金屬離子與雙螺旋ctDNA分子結(jié)合的強弱，依次為Cr(Ⅲ)＞ Cd(Ⅱ)＞Pb(Ⅱ)。第四部分：以MB為分子探針，用紫外吸收光譜、熒光光譜和熒光偏振研究了百草枯與ctDNA的相互作用。

7、MB分子主要以嵌插方式結(jié)合到ctDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上，而百草枯以非競爭方式抑制MB與ctDNA的結(jié)合，同時百草枯對MB和MB-ctDNA體系的熒光偏振均無影響，結(jié)果表明百草枯與ctDNA間為非嵌插結(jié)合。NaCl對百草枯與ctDNA之間的結(jié)合具有顯著的抑制作用，因此我們推測帶正電荷的百草枯離子可能通過與ctDNA鏈上帶負電荷的磷酸基以靜電相吸的方式結(jié)合而堆積在雙螺旋ctDNA分子表面，引起ctDNA分子收縮，減弱了結(jié)合位點附近MB分子與ct