太湖溶藻芽孢桿菌的溶藻作用及機(jī)制研究.pdf

1、針對我國湖泊面臨的嚴(yán)重富營養(yǎng)化及其災(zāi)害問題，探索浮游藻類生物量的控制、抑制“水華”發(fā)生、改善湖泊水質(zhì)的有效途徑是非常必要的。溶藻細(xì)菌作為水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分對維持藻類生物量平衡具有重要的作用，一些國外研究者認(rèn)為水華的突然消亡就可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華防治的微生物已引起越來越多的關(guān)注。 本課題前期在太湖現(xiàn)場放置的除藻中試裝置中，以維綸(聚乙烯醇纖維)作為人工介質(zhì)，采用自然富集的方法進(jìn)行掛

2、膜，富集溶藻細(xì)菌，對太湖水體進(jìn)行除藻研究，取得了較為滿意的除藻效果。并在已掛膜并經(jīng)一段時期運行的維綸介質(zhì)上成功分離篩選出1株溶藻細(xì)菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。對其進(jìn)行溶藻機(jī)制的初步探討，發(fā)現(xiàn)它主要是通過胞外分泌物作用于藻細(xì)胞而溶藻的。此外，前期研究中還初步建立了針對溶藻假單胞菌屬的PCR定性、定量檢測技術(shù)，并應(yīng)用于太湖流域現(xiàn)場的溶藻細(xì)菌監(jiān)測。 在此基礎(chǔ)上，本課題旨在從太湖除藻中試裝置中分離篩選溶藻效果較顯著的新的溶藻細(xì)菌，對其溶藻

3、能力進(jìn)行評價；在細(xì)菌溶藻機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，分離純化和鑒定出高效且避免二次污染的細(xì)菌溶藻物質(zhì)，對該活性物質(zhì)的溶藻能力及生物安全性進(jìn)行初步評價。同時對溶藻細(xì)菌進(jìn)行固定化研究，篩選固化效果最佳的溶藻細(xì)菌．人工介質(zhì)復(fù)合體并對其溶藻能力進(jìn)行評價；進(jìn)一步完善環(huán)境溶藻細(xì)菌的RTQ-PCR定量檢測技術(shù)，為該技術(shù)應(yīng)用于富營養(yǎng)化水體治理提供科學(xué)依據(jù)。 1．太湖溶藻芽孢桿菌的分離與評價以維綸(聚乙烯醇纖維)作為人工介質(zhì)，在太湖現(xiàn)場采用自然富集的方法

4、進(jìn)行掛膜，富集溶藻細(xì)菌。從經(jīng)一段時間運行并取得較滿意除藻效果的維綸介質(zhì)上分離篩選溶藻效果較顯著的細(xì)菌，經(jīng)生理、生化檢測及16S rRNA熒光圖譜鑒定為芽孢桿菌屬。對其溶藻效果進(jìn)行評價：在4.5×10<'7>個/ml的銅綠微囊藻液中，不同濃度的溶藻芽孢桿菌均顯示有溶藻作用，作用的強弱與細(xì)菌濃度相關(guān)。lO<'3>-10<'7>個/ml菌液的24h溶藻率分別為11﹪、33﹪、53﹪、71﹪、基金資助：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)資助項目(

5、2002AA601011)江蘇省自然科學(xué)基金(BK2005068)教育部博士點專項科研基金(20050286035)92﹪。溶藻芽孢桿菌的溶藻作用強弱與藻細(xì)胞濃度也呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，該細(xì)菌作用10<'5>-10<'9>個/ml藻液24h后藻細(xì)胞去除率分別為98﹪、88﹪、59﹪、41﹪、22﹪。藻毒素降解試驗：在作用第18、36、54、72h后，細(xì)菌對總藻毒素降解率分別為15﹪、29﹪、73﹪、100﹪。對其溶藻機(jī)制進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)其菌液

6、胞外濾液有溶藻作用。應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)檢測溶藻細(xì)菌在維綸介質(zhì)上的細(xì)菌豐度，監(jiān)測不同時間空間太湖中試除藻裝置中人工介質(zhì)對溶藻細(xì)菌的富集效果。7、8、9三個月假單胞菌屬、芽孢桿菌屬在環(huán)境樣本中的豐度均呈遞增趨勢，10月假單胞菌屬、芽孢桿菌屬在環(huán)境樣本中的豐度與9月相比無明顯變化，豐度基本保持在一個水平。11月、12月假單胞菌屬在環(huán)境樣本中的豐度急劇下降，芽孢桿菌屬豐度有所下降但幅度不大。 2.溶藻芽孢桿菌活性物質(zhì)的分離、鑒定及

7、評價應(yīng)用化學(xué)分離提取方法從溶藻細(xì)菌的胞外代謝產(chǎn)物中分離篩選出溶藻物質(zhì)，經(jīng)<'1>Ht-NMR，<'13>C-NMR，紅外，高分辨質(zhì)譜確證該溶藻物質(zhì)分子式為C<,6>H<,15>N<,4>O<,2>。分子量為175.1204。該物質(zhì)對10<'7>個/ml微囊藻細(xì)胞的48小時溶藻EC<,50>為0.373 mg/ml。95﹪可信區(qū)間為0.350mg/ml-0.397mg/ml。中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞毒性試驗表明該物質(zhì)在0.4mg/ml-0.1

8、mg/ml劑量范圍無細(xì)胞毒性。對芽孢桿菌胞外濾液的溶藻活性進(jìn)行定量分析，并與芽孢桿菌菌液的溶藻效果進(jìn)行比較：對10<'7>個/ml微囊藻細(xì)胞作用48小時后10ml、30ml、60ml、90ml去菌體濾液的藻細(xì)胞去除率分別為29﹪、44﹪、70﹪、96﹪，90ml去菌體濾液的溶藻效果與10ml相同菌體濃度發(fā)酵液的溶藻效果相當(dāng)。對分離提取過程的各級中間提取物進(jìn)行活性追蹤，對10<'7>個/mI微囊藻細(xì)胞作用48小時后去菌體濾液、濃縮濾液、萃

9、取水層、甲醇溶解液固體殘渣的藻細(xì)胞去除率分別為100﹪、91﹪、84﹪、80﹪。表明在分離提取過程中溶藻活性有所損失。對分離提取過程中間提取物進(jìn)行急性溶藻試驗，確定各中間提取物的48小時溶藻EC<,50>：芽孢桿菌發(fā)酵液的48小時溶藻EC<,50>為10<'3>個/ml，芽孢桿菌胞外濃縮濾液的48小時溶藻EC<,50>為2.94× 10<'-2>ml/ml，芽孢桿菌胞外氯仿萃取水層的48小時溶藻EC<,50>為5.47×10<'-2>m

10、l/ml，芽孢桿菌胞外甲醇溶解液固體殘渣的48小時溶藻EC<,50>為20.5 mg/ml。 3.溶藻芽孢桿菌的固定化與評價對MTT比色法應(yīng)用于檢測活菌數(shù)的可行性及實驗條件進(jìn)行探討，確定MTT法可以應(yīng)用于細(xì)菌計數(shù)，但有一定的適用范圍。應(yīng)用海藻酸鈉和聚乙烯醇包埋法固定溶藻細(xì)菌，對兩種固化細(xì)菌的固化效果及溶藻效果進(jìn)行評價：PVA-SA固化小球的機(jī)械強度比海藻酸鈉固化小球好；海藻酸鈉固化小球的傳質(zhì)能力比PVA-SA固化小球好。BG

11、ll藻培養(yǎng)液中海藻酸鈉固化芽孢桿菌、PVA-SA固化芽孢桿菌、游離芽孢桿菌的48小時溶藻率為98﹪、79﹪、93﹪：加入細(xì)菌營養(yǎng)物質(zhì)的BGll藻培養(yǎng)液中海藻酸鈉固化芽孢桿菌、PVA-SA固化芽孢桿菌、游離芽孢桿菌的48小時溶藻率為100﹪、93﹪、94﹪。應(yīng)用聚乙烯醇(PVA)纖維(太湖現(xiàn)場已運行一段時間并取得較滿意除藻效果的介質(zhì))、聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維膜、聚乳酸(PLLA)納米纖維膜(本課題組運用新型電紡技術(shù)新近合成的納米纖維)