異養(yǎng)硝化菌Alcaligenes faecalis strain NR氮代謝途徑的研究.pdf

1、異養(yǎng)硝化通常是指異養(yǎng)型微生物在好氧條件下將還原態(tài)有機(jī)氮或氨氮氧化成羥胺、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的過程。但有研究表明許多異養(yǎng)硝化菌在進(jìn)行硝化作用的過程中還檢測(cè)到含氮?dú)鈶B(tài)產(chǎn)物（N2O、N2）的生成，即此類異養(yǎng)硝化菌可在好氧條件下完成氨氮到氣態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，該過程也被稱為異養(yǎng)脫氮。Alcaligenes faecalis strain NR（GenBank登錄號(hào)FJ151629）是從具有同步硝化反硝化功能的膜生物反應(yīng)器中分離得到的異養(yǎng)型硝化菌。前期的研

2、究已證實(shí)該菌具有異養(yǎng)脫氮的功能。
　　本文通過檢測(cè)Alcaligenes faecalis strain NR代謝氨氮過程中出現(xiàn)的含氮中間產(chǎn)物，考察了該菌對(duì)這幾種中間產(chǎn)物的利用情況，并結(jié)合同位素示蹤試驗(yàn)初步推導(dǎo)了該菌的氮代謝途徑；利用超聲波細(xì)胞破碎法對(duì)參與氨氮代謝過程的關(guān)鍵酶進(jìn)行提取和活性測(cè)定，從酶學(xué)角度對(duì)代謝途徑的推導(dǎo)進(jìn)行論證；通過硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)羥胺氧化酶（HAO）進(jìn)行富集和部分純化，并對(duì)HAO催化氧化NH2OH的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)

3、行分析，從而進(jìn)一步對(duì)Alcaligenes faecalis strain NR氮代謝途徑的推導(dǎo)進(jìn)行論證。
　　通過分析Alcaligenes faecalis strain NR代謝氨氮過程中出現(xiàn)的含氮中間產(chǎn)物，并考察該菌對(duì)這幾種中間產(chǎn)物（NH2OH-N、NO2-N、NO3-N）的利用情況，再結(jié)合同位素示蹤試驗(yàn)初步推導(dǎo)出該菌對(duì)氨氮的代謝可能存在著兩種途徑：①與傳統(tǒng)的生物脫氮途徑相似，即以NO2--N為硝化和反硝化的結(jié)合點(diǎn)，通過硝

4、化和反硝化作用進(jìn)行生物脫氮；②另一條途徑為NH4+-N先是被轉(zhuǎn)化為NH2OH-N，然后生成的NH2OH-N被直接轉(zhuǎn)化為N2O而不經(jīng)過傳統(tǒng)的反硝化過程。
　　超聲波細(xì)胞破碎提取關(guān)鍵酶的單因素實(shí)驗(yàn)表明：總輻射時(shí)間為300s，超聲波破碎功率為300w，單次輻射時(shí)間為5s，菌液濃度為OD600=1.535時(shí)，提取效果在各自工作條件下最佳。響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超聲波細(xì)胞破碎的最佳工作條件為功率310w，總輻射時(shí)間400s，單次輻射時(shí)間5

5、s，菌液濃度OD600=1.930。在最佳工作條件下提取的粗酶液中檢測(cè)到了HAO、Nar、Nir的活性，其酶比活力依次為23.75、3.29和12.16mU/mg protein。結(jié)合中間產(chǎn)物利用途徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，推導(dǎo)出NR菌代謝氨氮時(shí)存在著硝化和反硝化兩套酶系統(tǒng)的作用，從而證明NR菌的氮代謝途徑中存在著一條硝化和反硝化結(jié)合的途徑。
　　利用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)關(guān)鍵酶HAO進(jìn)行富集和部分純化，結(jié)果表明：硫酸銨飽和度在50％~65%的梯