2012版分子細(xì)胞生物學(xué)的研究方法-期末

1、....一陳瑞川（1）GenetransfertogetstablecelllineA.Transient（短暫的）transfection1.Liposome（脂質(zhì)體）mediatedgenetransfer:Lipofectamine（脂質(zhì)體）transfection2.Ca2.Ca2.Ca33(PO(PO(PO44))22––mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfert

2、ransfer3.PEI3.PEI3.PEI（（聚乙二胺））mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfertransfer4.4.4.ElectropationElectropationElectropation（（電穿孔））B.Stabletransfection1.Adenovirusinfection（腺病毒感染）2.Retrovirusinfection（反轉(zhuǎn)錄病毒載體法

3、）3.Lentivirusinfection（慢病毒載體轉(zhuǎn)染法）4.Cotransfection.（2）HowtogetStablecellline1.Infectioncotransfection2.Antibioticsion3.Coloniesgrowth4.Expressiondetection5.Celllinestage（（33））HomologyHomologyHomologysearchsearchsearchofofo

4、fexistingexistingexistingcDNAcDNAcDNAdatadatadatabasesbasesbasesGenBankGenBankGenBankBlastBlastBlastNCBINCBINCBIBlastBlastBlastHomeHomeHomePage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.

5、nih.govBLASTGoGoGotototoProteinProteinProteinBlastBlastBlastPagePagePagePastePastePasteyouryouryourproteinproteinproteinsequencesequencesequenceenterenterenteraccessionaccessionaccessionnumbernumbernumberofofofyouryouryo

6、urproteinproteinproteinintointointothethetheboxboxboxUsuallyUsuallyUsuallyProteinproteinProteinproteinProteinproteinBlast.Blast.Blast.AK056946AK056946AK056946HomoHomoHomosapienssapienssapienscDNAcDNAcDNAFLJ32384FLJ32384F

7、LJ32384fisfisfiscloneclonecloneSKMUS1000104SKMUS1000104SKMUS1000104weaklyweaklyweaklysimilarsimilarsimilartototoHomoHomoHomosapienssapienssapiensmRNAmRNAmRNAfffHEXIM1HEXIM1HEXIM1proteincompleteproteincompleteproteincompl

8、etecds.cds.cds.二二二二俞春東俞春東俞春東俞春東（（11））什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？答：答：答：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：是經(jīng)連續(xù)是經(jīng)連續(xù)是經(jīng)連續(xù)202020代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）

9、的全同胞兄妹交配（或親代與子代交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內(nèi)所有個(gè)體都可追溯到起源于第202020代或以后代或以后代或以后代數(shù)的一對(duì)共同祖先。代數(shù)的一對(duì)共同祖先。代數(shù)的一對(duì)共同祖先。特性：特性：特性：特性：1.1.1.基因位點(diǎn)的純合性（基因位點(diǎn)的純合性（基因位點(diǎn)的純合性（HomozygosityHomozygosityHomozyg

10、osity））近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)近交系動(dòng)物中任何一個(gè)基因位點(diǎn)上純合子的概率高達(dá)999999％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖....毛色毛色毛色agoutiagoutiagouti棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）應(yīng)用：1980年代，具穩(wěn)定性的小鼠胚胎干細(xì)胞株皆源自129Sv純系小鼠。1990年代，基因定位(genetargeting)試驗(yàn)結(jié)

11、果證實(shí)其為極成功的動(dòng)物模型。4.4.4.FVBFVBFVB系系毛色白化毛色白化毛色白化起源起源起源源自遠(yuǎn)交系源自遠(yuǎn)交系源自遠(yuǎn)交系SwissSwissSwiss鼠。鼠。鼠。193519351935年，在年，在年，在NIHNIHNIH飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，196619661966年起開始選育，在年起開始選育，在年起開始選育，在接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系HSFSNHSFSNHSFSN對(duì)組胺對(duì)組胺

12、對(duì)組胺(Histamine)(Histamine)(Histamine)敏感。敏感。敏感。707070年代年代年代初，在初，在初，在HSFSNHSFSNHSFSN系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶Fv1Fv1Fv1bb基因?qū)驅(qū)驅(qū)BstrainstrainstrainFriendFriendFriend白白血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成Fv1Fv1Fv1bb同型合子近

13、交系，稱同型合子近交系，稱同型合子近交系，稱FVBFVBFVB。。NIHNIHNIH、、JacksonJacksonJackson等保等保等保存。存。存。應(yīng)用：應(yīng)用：應(yīng)用：FVBFVBFVB通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯通用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，有較強(qiáng)的繁殖力，窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射DNADN

14、ADNA。。3.3.3.我國(guó)培育的小鼠近交系我國(guó)培育的小鼠近交系我國(guó)培育的小鼠近交系我國(guó)培育的小鼠近交系1946年，我國(guó)從印度Haggkine研究所引入小鼠，這是當(dāng)今廣泛應(yīng)用的昆明種小鼠昆明種小鼠的原種。應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)（（11）遺傳組成和遺傳性狀一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一致，因此，只需用少量的動(dòng)物

15、就可得到非常規(guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（（22）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是組織細(xì)胞和腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。實(shí)驗(yàn)中最為理想的材料。（（33）明顯的生物學(xué)特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對(duì)某些因子敏感和耐受）明顯的生物學(xué)

16、特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對(duì)某些因子敏感和耐受）明顯的生物學(xué)特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對(duì)某些因子敏感和耐受等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。等，這些特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)研究中是天然模型。（（44）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對(duì)某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對(duì)某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影）多個(gè)近交系同時(shí)使用不僅可分析不同遺傳組成對(duì)某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)與影響，還可

17、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。響，還可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。響，還可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有普遍意義。190919091909年，年，年，C.C.C.C.C.C.LittleLittleLittle首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了DBADBADBA近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展史上發(fā)展史上發(fā)展史上第一個(gè)近交系動(dòng)物。第一個(gè)近交系動(dòng)物。第一個(gè)近交系動(dòng)物

18、。第一個(gè)近交系動(dòng)物。（（22））設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用基因敲除的方法研究一個(gè)基因的作用?；蚯贸ɑ蚯贸ɑ蚯贸ɑ蚯贸╧nockoutknockoutknockout））是是202020世紀(jì)世紀(jì)世紀(jì)808080年代后半期應(yīng)用年代后半期應(yīng)用年代后半期應(yīng)用DNADNADNA同源重組原理發(fā)展起來同源重組原理

19、發(fā)展起來同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)，指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)的一門新技術(shù)，指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)的一門新技術(shù)，指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推驗(yàn)，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因

20、的功能。測(cè)相應(yīng)基因的功能。測(cè)相應(yīng)基因的功能。目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動(dòng)物最常使用的是小鼠（常用的品系為129SV129SV129SV）的）的）的ESESES細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞主要是因?yàn)橹饕且驗(yàn)橹饕且驗(yàn)镋SESES細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的多潛能細(xì)胞建立的，在體細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的多潛能細(xì)胞建立的，在體細(xì)胞是利用小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中

21、的多潛能細(xì)胞建立的，在體外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（LIFLIFLIF）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外ESESES細(xì)胞有細(xì)胞有細(xì)胞有利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。步驟：步驟：1.構(gòu)建打靶載體（含有一段與欲敲除的基因具有高度同源性外