空心玻璃微球表面仿生沉積磷灰石涂層細(xì)胞微載體的研究.pdf

1、組織工程研究的主要目的是利用活細(xì)胞和生物材料，體外培養(yǎng)或者構(gòu)建組織和器官，以修復(fù)或替代損傷的組織或器官。種子細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)組織重建的前提和基礎(chǔ)，利用微載體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)組織工程種子細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，是現(xiàn)如今最常用、最有效的方法。目前，大多數(shù)微載體材料仍是聚合物，制備新型的生物性能優(yōu)良的微載體材料仍是組織工程與再生醫(yī)學(xué)比較重要的問(wèn)題。羥基磷灰石(HA)具有優(yōu)良的生物活性和生物相容性，被認(rèn)為是一種潛在的細(xì)胞培養(yǎng)微載體材料。然而，因HA的理論密度較高

2、限制了其作為微載體材料的應(yīng)用。對(duì)HA復(fù)合高分子類(lèi)材料的微載體已有研究，但是HA復(fù)合無(wú)機(jī)材料作為細(xì)胞培養(yǎng)微載體的相關(guān)研究還很少?？招牟Ａ⑶?HGM)以其良好的物理化學(xué)性質(zhì)被廣泛地開(kāi)發(fā)利用，在其表面涂覆不同性質(zhì)的涂層，可使其具有不同的功能特性。
　　 本研究針對(duì)HGM的物理化學(xué)性質(zhì)，選擇NaOH，Ca(OH)2和Piranha溶液三種不同的表面處理方式對(duì)其進(jìn)行表面活化，通過(guò)簡(jiǎn)易的仿生沉積的方法在其表面沉積了HA涂層，制備出了HA-

3、HGM復(fù)合空心微球。同時(shí)，對(duì)三種不同表面處理方式的機(jī)理進(jìn)行了討論，優(yōu)化了每種處理方式的工藝參數(shù)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征，確定了合適的表面處理方式。通過(guò)調(diào)整沉積時(shí)間、模擬體液(SBF)的濃度、液固比等參數(shù)，分別利用X射線衍射儀(XRD)、紅外光譜分析儀(FTIR)、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、比表面積分析儀(SSA)、高分辨透射電鏡(HRTEM)、X射線光電子能譜儀(XPS)、掃描探針顯微鏡(SPM)等手段對(duì)涂層的相組成、原子

4、團(tuán)、形貌、比表面積、微觀結(jié)構(gòu)、表面成分以及表面粗糙度進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，優(yōu)化出沉積工藝，并探索了煅燒對(duì)HA涂層微觀結(jié)構(gòu)和性能的影響。在此基礎(chǔ)上，選取了兩種HA-HGM復(fù)合空心微球，對(duì)MC3T3成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)MTT法檢測(cè)了細(xì)胞的增殖率，并檢測(cè)了堿性磷酸酶(ALP)活性和細(xì)胞分泌蛋白的功能，初步研究了HA-HGM復(fù)合空心微球作為成骨細(xì)胞培養(yǎng)微載體的性能。
　　 結(jié)果表明，HGM主要組成成分是SiO2和Al2O3，呈中空灰白

5、色的規(guī)則球形，表面光滑，主要由短棒狀的晶體和非晶玻璃體組成。三種表面處理方式均可激發(fā)HGM的化學(xué)活性，激發(fā)的機(jī)理有所不同，但是關(guān)鍵還是使Si-O鍵和Al-O鍵斷裂，破壞其Si-O-Si或Si-O-Al網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)三種方式不同表面處理后，利用仿生沉積法均可在HGM表面沉積碳酸化的HA。通過(guò)分析HA涂層的結(jié)構(gòu)和性能，以操作簡(jiǎn)便易行和無(wú)危險(xiǎn)性為原則，選擇最優(yōu)的表面處理方式是HGM在1mol/LNaOH溶液中于36.5℃下處理2h。
　

6、　 沉積時(shí)間、SBF的濃度以及液固比等條件對(duì)沉積層HA的結(jié)構(gòu)和性能有明顯的影響。隨著沉積時(shí)間的延長(zhǎng)，HA涂層的厚度不斷增加，沉積速度約為0.14μm/day。沉積時(shí)間延長(zhǎng)到15天后，沉積層的生長(zhǎng)速度變得緩慢，浸泡18天后生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。這主要是由于沉積層厚度增加，使得作為HA的形核點(diǎn)的富硅層溶解出的速度降低引起的。同時(shí)，浸泡時(shí)間為15天時(shí)，涂層表面部分出現(xiàn)微裂紋，而且隨浸泡時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，微裂紋增加，甚至使涂層從HGM表面脫落。在低濃

7、度的SBF溶液中，HGM表面不能沉積HA涂層，只有在1.5倍以上濃度的SBF溶液中才能順利沉積HA涂層。SBF濃度增大對(duì)沉積層生長(zhǎng)速度的影響并不明顯。液固比也是影響沉積層性能的一個(gè)重要因素，研究表明，在1.5SBF溶液中，只有液固比在高于150∶1以上才能沉積HA涂層。在本研究條件下，合適的工藝參數(shù)是無(wú)生物玻璃活化，1.5SBF，液固比150∶1，沉積時(shí)間15天。
　　 仿生沉積的HA涂層表面以片狀的結(jié)構(gòu)相互交錯(cuò)，彎曲排列而成，

8、形成花瓣?duì)?。涂層的結(jié)晶度不高，并且是含有碳酸根的類(lèi)骨磷灰石，厚度約為2μm，孔徑大小約為100nm，可以促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的響應(yīng)，有利于細(xì)胞的黏附與增殖和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞功能。HA沉積層由近基體的致密層和近表面的多孔疏松層的雙層結(jié)構(gòu)組成。
　　 在500-800℃之間對(duì)微球進(jìn)行煅燒處理，總體上隨煅燒溫度升高，HA涂層的比表面積迅速降低，孔徑尺寸不斷增大，花瓣?duì)疃嗫仔蚊蚕?，逐漸由納米顆粒代替。煅燒溫度為600℃時(shí)，總孔體積最大(0

9、.0359ml/g)，孔分布均勻。這主要是因?yàn)殪褵^(guò)程中碳酸根不斷從HA涂層晶體中釋放出來(lái)，同時(shí)，多孔花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)變成均勻的納米顆粒組成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。煅燒溫度升高到700℃時(shí)，沉積層內(nèi)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化生成磷酸三鈣(TCP)。HRTEM結(jié)果表明，沉積層HA中含有少量的非晶，片狀結(jié)構(gòu)存在于整個(gè)涂層中。經(jīng)過(guò)煅燒處理后，組成HA的顆粒成棒狀結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度升高，表面粗糙度先降低后升高。
　　 選取未煅燒(HA-w)和600℃(HA-600)

10、煅燒30min的HA-HGM復(fù)合空心微球?yàn)檠芯繉?duì)象，以MC3T3成骨細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞，研究了復(fù)合微球?qū)Τ晒羌?xì)胞培養(yǎng)的能力。研究表明，對(duì)MC3T3培養(yǎng)24h后，成骨細(xì)胞能較好的在空心微球表面進(jìn)行黏附和鋪展。煅燒后的樣品，因HA涂層與基體HGM結(jié)合強(qiáng)度降低，使得在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中部分涂層發(fā)生脫落現(xiàn)象，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和形貌觀察造成了不利影響。而且發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞在HGM基體上呈現(xiàn)薄膜狀態(tài)，無(wú)細(xì)胞核存在，這說(shuō)明HGM本身不利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。